בצומת המבחנה Neuromuscular המושרה מתאי גזע פלורופוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

1. הכנת לוחות מצופה מטריצה חוץ-תאית (ECM) דילו ECM (ראה טבלת חומרים)עם קרח קר 1x PBS לריכוז סופי של 2%. הוסף 1 מ”ל של ECM ל 49 מ”ל של PBS 1x בצינור פלסטיק 50 מ”ל. מערבבים היטב על ידי התפתלות למעלה ומטה מספר פעמים. מניחים 1 כיסויים לתוך כל באר של צלחת 6-באר. להוסיף 1.5 מ”ל של 2% ECM לכל באר. דגירה את צלחת הבאר עם 2% ECM עבור 2 שעות ב 37 ° C. שאפף ECM מצלחת הבאר ולאחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. 2. בידול של iPSCs לכיוון NMJ זרע 4 x 105 של iPSCs לכל באר על צלחת 6-באר מוכן בסעיף 1. הקפד לזרוע את התאים על כיסוי שהופקד מראש בבאר.הערה: במחקר זה, 201B7MYOD iPS קו התא, מתנה מהמעבדה של ד”ר Sakurai,שימש 15. הסר את המדיום מה- iPSCs בצלחת התרבות בגודל 6 ס”מ ושטוף את ה- iPSCs פעם אחת עם PBS אחד. מוסיפים 1 מ”ל של תמיסת נתק תאים לצלחת ותדגירה במשך 10 דקות ב-37°C. מוסיפים 3 מ”ל של תא גזע עוברי יונק (ES) לצלחת ופיפטה 3 פעמים בעדינות. אספו את הסופרנטנט, המכיל iPSCs מנותק, לתוך צינור פלסטיק 50 מ”ל וצנטריפוגה ב 160 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות. בזהירות לשאוף את supernatant, להשתמש מחדש iPSCs ב 3 mL יונק ES תא בינוני עם 10 μM Y27632, ולספור את מספר התא באמצעות hemocytometer. לדלל את iPSCs עם תא ES יונק בינוני ו 10 μM Y27632 לריכוז של 2 x 105 תאים / מ”ל. הוסף 2 מ”ל של iPSCs על מכסה שהופקד מראש בבאר המתוארת בסעיף 1. אינדוקציה של iPSCs ל- NMJ ביום 1, 24 שעות לאחר זריעת iPSCs לצלחת 6-well, להסיר את מדיום התרבות ולהחליף אותו עם 2 מ”ל של טרי יונק ES תא בינוני המכיל 1 μg / מ”ל דוקסיציקלין לכל באר. שנה את המדיום עם 2 מ”ל של מדיום בידול myogenic (MDM) (טבלה 1) המכיל 1 μg / מ”ל דוקסיציקלין (ריכוז סופי) לכל באר. רענן את המדיום מדי יום מיום 2 עד יום 10. מהיום ה-11, החלף את המדיום ל-2 מ”ל של NMJ בינוני(טבלה 1)לכל באר. רענן את המדיום כל 3\u20124 ימים לאחר מכן עד היום ה-30. שימו לב ל-NMJ המבדיל לפי שלב של מיקרוסקופיה הפוכה ביום ה-30. ניתן להשתמש ב- NMJ עבור הניתוח הבא. 3. כתמים חיסוניים (IF) ביום ה-30, לשאוף למדיום התרבות מצלחת 6-באר. לתקן את תרבות NMJ על ידי הוספת 2 מ”ל של 4% paraformaldehyde לכל באר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הדגימות 3 פעמים על ידי הוספת 2 מ”ל של 1x PBS לכל באר (3 דקות עבור כל שטיפה). לחלחל את הדגימות עם 0.1% Triton / PBS במשך 10 דקות. חזור על שלב 3.2. חסמו את הדגימות עם 0.5% BSA למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. חזור על שלב 3.2. דגירה הדגימות עם הנוגדנים העיקריים ב 4 ° C לילה. דילול הנוגדנים הוא כדלקמן: איילט 1 (1 μg/mL), שרשרת כבדה מיוסין (MYH) (1/300), neurofilaments (NF) (1 μg /mL), S-100 (1/300), חלבון שלל הסינטי 2 (SV2) (1 μg/mL), Tuj1 (1/1000). חזור על שלב 3.2. דגירה הדגימות עם הנוגדנים המשניים בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה. הריכוז של הנוגדנים המשניים המשמשים הוא כדלקמן: אנטי-עכבר IgG 488 ביחיד (0.1 μg/mL), אנטי ארנב IgG 488 בהתוות (0.1 μg/ mL). חזור על שלב 3.2. דגירה הדגימות עם aBTX-647 (0.5 μg / מ”ל) עבור כתמי AChR עם DAPI (1 μg / מ”ל) עבור כתמים גרעין. חזור על שלב 3.2. להרים את כיסוי עם זוג מפסים מצלחת 6-באר ולהר אותו ב50% גליטרול / PBS פתרון על שקופית מיקרוסקופ. 4. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) לתקן את תרבות NMJ עם 4% paraformaldehyde ו 1% גלוטראלדהייד מוכן 0.1 M אשלגן פוספט מאגר בטמפרטורת החדר עבור 1 שעות. לשטוף את הדגימות 3 פעמים על ידי טבילה אותם 0.1 M אשלגן פוספט מאגר בטמפרטורת החדר (10 דקות עבור כל שטיפה). מייבשים את הדגימות עם ריכוזים עולים של אתנול (50%, 70%, 90%, 95% ו-100% פעמיים). לטבול את הדגימות בכל ריכוז של אתנול במשך 10 דקות. יבש את הדגימות על ידי מייבש נקודה קריטית (-30 °C, 0.1 טור). ציפוי הדגימות עם Pt (פלטינה) מעיל יון (30 mA במשך 3 דקות; עובי Pt הוא כ 20 נה”מ). שים לב לדגימות על ידי SEM ב 5 kV. 5. מיקרוסקופאלקטרונים שידור (TEM) השתמש במגרד תאים כדי לקצור את הרקמה מצלחת התרבות של NMJ. מעצבים את הרקמה לגלולה קטנה (3 מ”מ3)עם סכין גילוח ודבק על ידי gelation כדי ליצור חתיכה עטופה בג’ל. תקן את החתיכה עטופה בג’ל עם 2% paraformaldehyde ו 2% גלוטראלדהייד מוכן 0.1 M אשלגן פוספט מאגר ב 4 מעלות צלזיוס לילה. לשטוף את הדגימות 3 פעמים על ידי טבילה אותם 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (15 דקות לכל שטיפה) בטמפרטורת החדר. לאחר תקיד את הדגימות עם 1% tetroxide osmium מוכן Hמזוקקכפול 2 O עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.התראה: צעד זה חייב להיעשות במכסה מנוע כימי. חזור על שלב 5.2. מייבשים את הדגימות עם ריכוזים עולים של אתנול (50%, 70%, 90%, 95% ו-100% פעמיים). לטבול את הדגימות בכל ריכוז של אתנול במשך 10 דקות. תאטפי את ה-100% אתנול. לחדור את הדגימות עם יחסי נפח עולה של שרף אפוקסי 100% תערובות אתנול (1:3, 1:1 ו 3:1). מסיתים כל תערובת בעדינות ב-10 סל”ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. החליפו את תערובת האפוקסי-אתנול עם שרף אפוקסי טהור ועצבני בעדינות ב-10 סל”ד למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר 4 שעות, לרענן את שרף אפוקסי עם שרף אפוקסי טרי ולהתסיס בעדינות ב 10 סל”ד לילה בטמפרטורת החדר. להטביע את הדגימות בהטבעת כמוסות עם שרף אפוקסי טרי ולרפא את הדגימות בתנור ב 65 מעלות צלזיוס לילה. אולטרה מיקרוטומיה חותכים גס את בלוקי הדגימה תחת מיקרוסקופ לנתח את הכיוון הנכון. חותכים דק את הקוביות הקצוצות ב גסות עם סכין זכוכית על אולטרה מיקרוטומה כדי להשיג משטחים חלקים. הכן קטעים דקים במיוחד של 70 ננ”מ מהבלוקים הקצוצים היטב עם סכין יהלום. אחזר את החלקים האולטרה-דקים עם רשתות נחושת עם 200 רשתות נחושת מצופה פחמן. מכתים את החלקים האולטרה דקים המכילים רשתות עם אצטט אורניל רווי שהוכן ב-H 2 Oמזוקקכפול במשך 30 דקות ושטוף את הרשתות 3 פעמים עם H2O מזוקק כפול (10 דקות לכל שטיפה). יתר על כן, בניגוד לסעיפים האולטרה דקים עם ציטראט עופרת של ריינולד19 (2.5%) במשך 5 דקות ולשטוף עם Hמבושל 2O מקורר מראש לטמפרטורת החדר 3 פעמים (10 דקות עבור כל שטיפה). לשים כמה כדורי נתרן הידרוקסיד סביב אזור ההכתמה כדי למנועמשקעים CO 2 על המקטעים. שים לב לחלקים האולטרה-דקים של TEM ב-70 kV. 6. התכווצות שרירים וטיפול בקורה כדי להפעיל את התכווצות myotube, להוסיף 25 mM CaCl2 במדיום תרבות בשלב 2.3. התנועה של myotubes ניתן לצפות ב 1\u20122 דקות. מניחים את צלחת 6-באר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. להקליט סרט של התכווצות myotube על ידי מיקרוסקופיה תא חי. כדי לעצור את התכווצות myotube, להוסיף curare למדיום התרבות (300 ng/mL). לאחר מכן להקליט את הסרט כצעד 6.2. פתח את קובץ הסרט באמצעות תוכנת ניתוח וקטור תנועה ולאחר מכן לחץ על לחצן ניתוח תנועה כדי לנתח את הסרט.הערה: התכווצות myotubes מוצגת כגרפיקת תנועת זמן. הסרטים מקודדים בצבע כדי להראות את מהירות התנועה של myotubes. האותות הנצנוץ המקודדים בצבע מצביעים על התנועות של מיוטובים שבהם הצבע האדום מציג את מהירות התנועה המהירה ביותר והצבע הכחול מציג את מהירות התנועה האיטית ביותר.