인체 유발 만능 줄기 세포에서 유도 된 체외 신경 근육 정션

1. 세포 외 매트릭스 (ECM) 코팅 플레이트의 준비 얼음 차가운 1x PBS로 ECM(재료표참조)을 최종 농도2%로 희석합니다. 50mL 플라스틱 튜브에 1x PBS의 49mL에 ECM 1mL를 추가합니다. 여러 번 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 6웰 플레이트의 각 웰에 1 개의 커버 슬립을 놓습니다. 각 웰에 2% ECM의 1.5mL를 추가합니다. 37°C에서 2시간 동안 2% ECM로 웰 플레이트를 배양한다. 웰 플레이트에서 ECM을 흡입하고 사용하기 전에 4 °C에서 플레이트를 저장합니다. 2. NMJ를 향한 iPSC의 차별화 종자 4 x 105 iPSC의 잘 섹션 1에 준비 된 6 웰 플레이트에. 우물에 미리 증착 된 커버 슬립에 세포를 시드해야합니다.참고: 이 연구에서는 사쿠라이 박사의 연구실에서 선물한 201B7MYOD iPS세포주(15)를사용했습니다. 6cm 배양 접시에 iPSC에서 매체를 제거하고 1x PBS로 한 번 iPSC를 세척합니다. 접시에 세포 분리 용액 1mL을 추가하고 37 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 접시에 영장류 배아 줄기 (ES) 세포 배지 3 mL을 넣고 부드럽게 3 번 넣습니다. 분리된 iPSC를 포함하는 상체를 50mL 플라스틱 튜브와 원심분리기의 160 x g에서 4°C에서 5분 동안 수집합니다. 수퍼네티드를 신중하게 흡습하고, 10 μM Y27632로 3mL 영장류 ES 세포 배지에서 iPSC를 재보중단하고, 혈류계를 사용하여 세포 수를 계산한다. 영장류 ES 세포 배지및 10 μM Y27632를 2 x 105 셀/mL의 농도로 iPSC를 희석시. 섹션 1에 설명된 우물에 미리 기탁된 커버슬립에 iPSC 2mL를 추가합니다. NMJ에 iPSC의 유도 1일째, 24h는 iPSC를 6웰 플레이트에 시드한 후 배양 배지를 제거하고 각각 1 μg/mL 독시클린을 함유한 신선한 영장류 ES 세포 배지 2mL로 교체한다. 근생 분화 배지(MDM)의 2mL(MDM)(표1)로매질을 각각 양호하게 1 μg/mL 독시클린(최종 농도)을 함유한다. 매일 2일부터 10일까지 매디지리를 새로 고칩니다. 11일부터, 중간을 NMJ배지(표 1)의2mL로 각각 양으로 전환한다. 30일까지 3\u20124일마다 배지를 새로 고칩니다. 30일째에 단계 반전 현미경검사법에 의해 분화된 NMJ를 관찰한다. NMJ는 다음 분석에 사용할 수 있습니다. 3. 면역 형광 (IF) 염색 30일째에, 6웰 플레이트에서 배양 배지를 흡인한다. 실온에서 30분 동안 각 웰에 4% 파라포름알데히드의 2mL를 추가하여 NMJ 문화를 수정합니다. 각 웰(각 세척당 3분)에 1x PBS 2mL을 추가하여 샘플을 3회 세척합니다. 10 분 동안 0.1 % 트리톤 / PBS로 샘플을 permeabilize. 3.2 단계를 반복합니다. 실온에서 1시간 동안 0.5%의 BSA로 샘플을 차단합니다. 3.2 단계를 반복합니다. 하룻밤 사이에 4°C에서 1차 항체로 샘플을 배양한다. 항체의 희석은 다음과 같습니다: 아일렛 1 (1 μg/mL), myosin 무거운 사슬 (MYH) (1/300), 신경 필라멘트 (NF) (1 μg/mL), S-100 (1/300), 시냅스 소포 단백질 2 (SV2) (1 μg/mL), Tuj11(10). 3.2 단계를 반복합니다. 1시간 동안 실온에서 이차 항체로 샘플을 배양한다. 사용되는 이차 항체의 농도는 다음과 같습니다: 항마우스 IgG 488 공주(0.1 μg/mL), 안티래빗 IgG 488 공주(0.1 μg/mL). 3.2 단계를 반복합니다. AChR 염색을 위한 aBTX-647(0.5 μg/mL)과 핵 염색을 위한 DAPI(1 μg/mL)로 샘플을 배양한다. 3.2 단계를 반복합니다. 6웰 플레이트의 집게로 커버슬립을 집어 들고 현미경 슬라이드에 50% 글리세롤/PBS 용액에 장착합니다. 4. 전자 현미경 검사 (SEM) NMJ 배양을 4% 파라포름알데히드와 1%의 글루타랄데히드로 1시간 동안 실온에서 0.1M 칼륨 인산염 버퍼로 제조하였다. 실온에서 0.1M 칼륨 인산염 버퍼에 침지하여 샘플을 3번 세척하십시오(각 세척당 10분). 에탄올의 상승 농도로 샘플을 탈수 (50%, 70%, 90%, 95%, 100% 두 번). 에탄올의 각 농도에 샘플을 10 분 동안 담그면 하십시오. 임계 점 건조기 (-30 °C, 0.1 토르)로 샘플을 건조. Pt(플래티넘) 이온 코터(3분 동안 30mA, Pt두께는 약 20nm)로 샘플을 코팅합니다. 5 kV에서 SEM에 의해 샘플을 관찰한다. 5. 전염 전자 현미경 검사법 (TEM) 세포 스크레이퍼를 사용하여 NMJ 배양 판에서 조직을 수확하십시오. 작은 펠릿 (3mm3)로조직을 면도날과 젤레이션에 의한 접착제로 모양을 만들어 젤로 감싼 조각을 형성합니다. 겔 로 싸인 조각을 2% 파라포름알데히드와 2% 글루타랄데히드로 고정하여 하룻밤 사이에 0.1M 칼륨 인산염 버퍼로 준비합니다. 실온에서 0.1M 칼륨 인산염 버퍼(각 세척당 15분)에 침지하여 시료를 3회 세척합니다. 실온에서 1시간 동안 이중 증류H2O로제조된 1% 오스뮴 테트산화물으로 샘플을 후정합니다.주의: 이 단계는 화학 적 후드에서 수행해야합니다. 5.2 단계를 반복합니다. 에탄올의 상승 농도로 샘플을 탈수 (50%, 70%, 90%, 95%, 100% 두 번). 에탄올의 각 농도에 샘플을 10 분 동안 담그면 하십시오. 100% 에탄올을 흡인합니다. 에폭시 수지의 상승 부피 비율로 시료에 침투하여 100% 에탄올 혼합물(1:3, 1:1 및 3:1). 각 혼합물을 실온에서 1시간 동안 10rpm에서 부드럽게 교반합니다. 에폭시 에탄올 혼합물을 순수한 에폭시 수지로 대체하고 실온에서 4 시간 동안 10 rpm에서 부드럽게 동요하십시오. 4 시간 후, 신선한 에폭시 수지로 에폭시 수지와 함께 새로 고침하고 실온에서 하룻밤 10 rpm에서 부드럽게 동요합니다. 신선한 에폭시 수지와 캡슐을 포함 캡슐에 샘플을 포함하고 하룻밤 65 °C에서 오븐에서 샘플을 치료. 초미세 절제술 올바른 방향을 위해 해부 현미경으로 샘플 블록을 거칠게 다듬습니다. 굵게 손질된 블록을 초미세토메에 유리 칼로 미세하게 다듬어 매끄러운 표면을 얻습니다. 다이아몬드 나이프로 잘 손질된 블록에서 70nm 초박형 섹션을 준비합니다. 200 메쉬 탄소 폼바 코팅 구리 그리드와 초박형 섹션을 검색합니다. 포화 우라일 아세테이트가 함유된 초박형 섹션은 30분 동안 이중 증류H2O로 제조하고 더블 증류H2O(각세척당 10분)로 그리드를 3번 세척합니다. 또한, 초박형 섹션을 레이놀드의 납 구연산 19(2.5%)와 대조합니다.19 5 분 동안 삶은 H2O로 씻어 3 번 (각 세척당 10 분)으로 미리 냉각됩니다. 섹션에 CO2 강수량을 방지하기 위해 염색 영역 주위에 여러 개의 수산화 나트륨 펠릿을 넣습니다. 70 kV에서 TEM에 의해 초박형 섹션을 관찰하십시오. 6. 근육 수축 및 큐레어 치료 심피튜브 수축을 트리거하려면 2.3단계에서 배양 배지에 25mM CaCl2를 추가합니다. myotube의 움직임은 1\u20122 분에서 관찰 할 수 있습니다. 반전 된 현미경의 무대에 6 웰 플레이트를 놓습니다. 라이브 셀 현미경 검사법에 의한 myotube 수축 의 영화를 기록합니다. 심오튜브 수축을 중지하려면 배양 배지(300 ng/mL)에 큐라레를 추가합니다. 그런 다음 영화를 6.2 단계로 기록합니다. 모션 벡터 분석 소프트웨어로 동영상 파일을 연다음 모션 분석 버튼을 클릭하여 동영상을 분석합니다.참고: myotube 수축은 시간 동작 그래픽으로 표시됩니다. 영화는 myotube의 이동 속도를 보여주기 위해 색상으로 구분됩니다. 색상으로 구분된 반짝이는 신호는 붉은 색이 가장 빠른 움직임 속도를 나타내고 파란색이 가장 느린 이동 속도를 나타내는 myotubes의 움직임을 나타냅니다.