Her leverer vi en protokol til at generere in vitro NMJs fra humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Denne metode kan fremkalde NMJs med modne morfologi og funktion i 1 måned i en enkelt brønd. De resulterende NMJs kunne potentielt bruges til at modellere relaterede sygdomme, til at studere patologiske mekanismer eller til at screene lægemiddelforbindelser til behandling.
Den neuromuskulære krydset (NMJ) er en specialiseret synapse, der overfører handling potentialer fra motoren neuron til skeletmuskulatur for mekanisk bevægelse. Arkitekturen i NMJ struktur påvirker funktionerne i neuron, musklen og den gensidige interaktion. Tidligere undersøgelser har rapporteret mange strategier ved co-culturing de motoriske neuroner og myotubes til at generere NMJ in vitro med komplekse induktion proces og lang kultur periode, men har kæmpet for at opsummere modne NMJ morfologi og funktion. Vores in vitro NMJ induktionssystem er konstrueret ved at differentiere menneskelig iPSC i en enkelt kulturskål. Ved at skifte myogene og neurogene induktionsmedium til induktion indeholdt den resulterende NMJ præ- og postsynaptiske komponenter, herunder motorneuroner, skeletmuskulatur og Schwann-celler i en måneds kulturen. Den funktionelle analyse af NMJ viste også, at myotubes sammentrækning kan udløses af Ca++ derefter hæmmet af curare, en acetylcholin receptor (AChR) hæmmer, hvor stimulerende signal overføres gennem NMJ. Denne enkle og robuste tilgang med succes afledt den komplekse struktur af NMJ med funktionelle tilslutningsmuligheder. Denne in vitro menneskelige NMJ, med sine integrerede strukturer og funktion, har lovende potentiale for at studere patologiske mekanismer og sammensatte screening.
Den neuromuskulære krydset (NMJ) er en specialiseret synapse, der sender signaler fra motoriske neuroner til skeletmuskulatur til at styre frivilligemuskelbevægelser 1,2. Denne synapse består af præ- og post-synaptiske dele. I den præ-synaptiske del frigiver den motoriske neuron acetylcholin (ACh) fra synaptiske vesikler ved exocytose. ACh er frigivet fra synaptiske vesikler til at krydse den synaptiske kløft og til at binde sig til AChR på post-synaptic del til at udløse en handling potentiale for muskelsammentrækning3,4. Enhver fejl i denne delikate struktur kan forårsage NMJ sygdomme, herunder spinal muskelatrofi (SMA), medfødt myasthenic syndromer (CMS), myasthenia gravis (MG)5,6,,7,osv. Disse sygdomme i høj grad skader kvaliteten af patienternes liv og desværre har ingen effektive behandling tilgange på grund af manglende forståelse for den patologiske mekanisme. I denne undersøgelse, Vi havde til formål at generere in vitro menneskelige NMJ fra menneskelige iPSCs for nøjagtig sygdom modellering og for terapeutiske forbindelser screening.
Tidligere undersøgelser har vist muligheden for at generere in vitro NMJ ved co-kultur strategier. De motoriske neuroner og skelet myotubes genereres henholdsvis. De to celletyper kan genereres fra humane eller mus primære væv kulturer eller induceres fra stamceller8,,9,10,11 ogderefter co-dyrket for NMJ dannelse. De yderligere anvendelser omfatter sammenlægning af co-kultiverede NMJ i microfluidic 3D-enheder og til at anvende optogenetiske enheder til kvantificerbare funktionelle analyser12,13. Men disse strategier tager en lang kultur periode og kræver kamp for at opnå de primære komponenter i NMJ, enten motor neuron eller skelet myotube samtidigt. Endnu en vigtig komponent i NMJ, Schwann-cellen, kan ikke genereres i disse kultursystemer. Den avancerede kultur system, der indeholder myotube, motor neuron og Schwann celle er ønskeligt, da det kan tilbyde en pålidelig og robust model for NMJ undersøgelser.
Myogen differentiering 1 (MYOD1) er en velkendt myogen regulator for myogenese14. Den effektive myogen differentieringsmetode, som anvendte MYOD1 til at køre iPSC ind i myotubes, blev bygget i en tidligere undersøgelse15. Derfor har vi induceret myotubes ved overexpressing MYOD1 i iPSCs15, og høj effektivitet af myogen differentiering blev vist. Interessant, neuron celler dukkede sammen med myotubes spontant efter dag 10. Fremkomsten af neuronceller i myogen kultur har fået os til at udvikle strategien for at generere in vitro NMJ i en enkelt skål. Her tilbyder vi en strategi for at generere NMJs ved at overexpresse MYOD1 i menneskelige iPSCs for myogenic og motor neuron induktion i samme kultur parabol. De motoriske neuroner induceres spontant med flere neurotrofiske faktorer (GDNF, BDNF, NT3, osv.) 8, og i mellemtiden kan Schwann celler også induceres16,17. Gennem samspillet mellem myotubes, motor neuroner og Schwann celler, den modne NMJ dannes18. Denne metode kan generere funktionelle NMJ effektivt, gør det muligt for den potentielle undersøgelse af patologiske mekanismer og terapeutisk sammensatte screening.
Tidligere undersøgelser har rapporteret metoder til NMJ dannelse in vitro med avanceredemetoder,der kræver langsigtet kultur8,10,,12,13,20. Disse resultater føre udviklingen af in vitro NMJ. De komplicerede metoder hindrede imidlertid nmj-undersøgelserne i at få adgang. Vores protokol undgår co-kultur til at generere NMJs effektivt og robust i en enkelt brønd. Tre celletyper i NMJ blev observeret i vores induktionssystem, herunder myotubes, motorneuroner og Schwann celler18. Desuden blev moden morfologi og funktion verificeret.
Baseret på vores tidligere undersøgelse, den oprindelige celletæthed er en kritisk faktor for NMJ dannelse, og forskellige celletætheder fremkalde forskellige antal NMJs i kulturen18. En lav celletæthed (< 1 x 104/cm2) inducerede et lavt antal neuroner, hvilket er ugunstigt for NMJ-formationen. Selv om det ville tage meget mere tid og ressourcer at forberede en højere tæthed af celler (> 1 x 105/cm2),anbefaler vi, at celletætheden være mellem 1,5 x 104/cm2 og 5 x 104/cm2 ved hjælp af vores protokol. NMJ genereret af denne protokol er en heterogen væv med flere celletyper, som er tættere på at efterligne fysiologiske forhold. Den myotubes findes at jævnt distribuere på en kultur parabol, men de motoriske neuroner vises tilfældigt, hvoraf fænomenet resulterer i ulige fordeling af NMJs i en kultur. Denne NMJ er velegnet til kvalitative undersøgelser i stedet for den analyse, der kræver homogene kultursystemer. Vi brugte også andre cellelinjer, eq., H9 (ES cellelinje)18 og A11 (iPS-cellelinje, data ikke vist) til at generere NMJ ved denne protokol. NMJ kan genereres med succes i morfologi og funktion. Kulturtilstanden skal dog optimeres til forskellige cellelinjer.
Den kemisk udløste myotubes sammentrækning og curare-afhængige hæmning bekræftet, at vores in vitro NMJ var funktionel og kunne potentielt anvendes til praktiske analyser. Spontane muskelsammentrækninger blev observeret tilfældigt ved 3\u20124 ugers kultur, men det kunne undgås ved at udvide kulturtiden til så længe som tomåneder 18.
Forskellige strategier er blevet offentliggjort for at generere in vitro NMJ af forskellige modning faser, men in vitro NMJ genereret i vores system viste den betydelige modenhed, som vi kan observere overgangen af gamma til epsilon underenheder af AChR under kulturen18. Modenhed er en vigtig overvejelse for sygdomsmodellering med in vitro NMJ21. Det kan konkluderes, at en in vitro NMJ med integrerede strukturelle komponenter, modenhed og funktion er til potentiel anvendelse til terapeutisk udvikling.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Sakurai for venligt at give 201B7MYOD. Den elektronmikroskopi undersøgelse blev støttet af Keiko Okamoto-Furuta og Haruyasu Kohda (Division of Electron mikroskopisk undersøgelse, Center for Anatomiske Studier, Graduate School of Medicine, Kyoto University). Det monoklonale antistof blev udviklet af HHMI/Columbia University, fremstillet af Developmental Studies Hybridoma Bank, skabt af National Institute Child Health and Human Development of the NIH, og vedligeholdes på Department of Biology, University of Iowa. Vi takker også Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa og Eriko Matsui for bevægelsesvektoranalyse. Dette arbejde blev støttet af midler fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI, tilskud numre 16H05352 og 20H03642 (til MKS); iPS Cell Research Fund (til CYL og MKS) Mochida Memorial Foundation for Medicinsk og farmaceutisk forskning (til MKS); Takeda Science Foundation (til MKS); og et tilskud fra The Program for Intractable Diseases Research udnytter sygdomsspecifikke iPS-celler, som blev hjulpet af Japan Agency for Medical Research and Development (17935400 til CYL og MKS, og 17935423 til MKS).
Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
Doxycycline | Takara | 631311 | |
ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
SEM | Hitachi | S-4700 | |
TEM | Hitachi | H7650 | |
Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |