免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

中枢神経系(CNS)は免疫学的に特殊な部位です。CSF腔、髄膜、および血管系を除くCNS実質は、古典的に免疫特権部位^1,2,3,4,5と見なされており、恒常性状態の間は免疫細胞が比較的ありません2,6,7。対照的に、硬膜、くも膜、および軟膜層で構成される髄膜は、CNSコンパートメントの重要な構成要素であり、疾患の病因中の恒常性免疫監視および炎症プロセスに積極的に関与しています3,6,7,8。定常状態の間、髄膜は、自然リンパ系細胞(ILC)、マクロファージ、樹状細胞(DC)、肥満細胞、T細胞、および程度は低いがB細胞を含む多数の免疫センチネル細胞をサポートする9,10,11。

髄膜は高度に血管新生した構造であり、CNSとその末梢との間にリンパ管接続を提供するリンパ管を含む8,12,13,14。CNS損傷、感染症、自己免疫、さらには神経変性によって誘発される炎症状態では、末梢由来の免疫細胞が実質に浸潤し、髄膜内の免疫ランドスケープを変化させます。細胞浸潤に続いて、髄膜は末梢由来の免疫細胞の機能的ニッチを表し、免疫細胞の凝集、局所免疫細胞の活性化、およびCNSコンパートメントでの長期生存を促進します。顕著な髄膜炎症は、多発性硬化症(MS)15、16、¹⁷、¹⁸、¹⁹、脳卒中20、21、無菌損傷22、²³(すなわち、脊髄損傷および外傷性脳損傷)、片頭痛²⁴、および微生物感染²⁵、²⁶を含む、CNSに影響を及ぼす複数の疾患において観察され^、27、^28、29。したがって、髄膜コンパートメント内の常在細胞および末梢由来免疫細胞の特性評価は、定常状態および疾患の病因におけるこれらの細胞の役割を理解するために不可欠です。

頭蓋体と椎体からの脳、脊髄、髄膜の抽出は、技術的に困難で時間がかかります。現在、3つの髄膜層すべてを無傷のままにして脳を迅速に抽出するために利用できる技術はありません。椎弓切除術は優れた脊髄組織の形態をもたらし、髄膜層を保存しますが、それは非常に時間がかかり、複雑です^30,31。逆に、頭蓋骨からの脳の除去および脊髄の水圧押し出しなどのより従来の抽出方法は、CNS組織の迅速な抽出を容易にするが、くも膜および硬膜髄膜の両方がこれらの技術で失われる^30,31。脳および脊髄組織の従来の単離中に硬膜およびくも膜層が省略されると、CNSコンパートメント内の細胞の不完全な分析がもたらされる。したがって、無傷の髄膜を有するCNS組織の迅速な抽出に焦点を当てた新しい技術の同定は、CNSコンパートメントの最適な分析にとって重要です。

この原稿は、マウスから脳、脊髄、髄膜を迅速に抽出するための2つの方法を提示し、CNS実質および髄膜の常在細胞および末梢由来免疫細胞の下流分析を容易にします。これらの最適化されたプロトコルは、1)ダウンストリーム分析用の単一細胞懸濁液の単離、および2)組織学的処理のための組織の準備に焦点を当てています。脳、脊髄組織、硬膜およびくも膜髄膜³²から単一細胞懸濁液を得ることは、実質および髄膜コンパートメントの両方に存在する細胞の同時分析を可能にする。シングルセル懸濁液は、in vitro刺激33、酵素結合イムノスポット(ELISpot)²⁸、³⁴、35、フローサイトメ^トリー36、³³、シングルセル³⁷またはバルクトランスクリプトミクスを実行するための細胞培養アッセイなど^、さまざまなアプリケーションで使用できます。さらに、無傷の頭蓋骨または脊柱を備えた脳全体と脊髄の脱灰に最適化されたプロトコルにより、周囲の骨を穏やかに脱灰し、髄膜を無傷のままにし、組織の形態を維持することができます。この方法では、実質空間と髄膜腔の両方で免疫組織化学(IHC)またはin situハイブリダイゼーション(ISH)技術を使用してタンパク質またはRNAを選択的に同定できます。CNS内の常在細胞および末梢由来免疫細胞の表現型、活性化状態、および局在の特性評価は、CNSコンパートメント内の個々の細胞タイプが恒常性と疾患の病因にどのように寄与するかを理解するために不可欠な情報を提供する可能性があります。