Выделение тканей центральной нервной системы и связанных с ними мозговых оболочек для последующего анализа иммунных клеток

Центральная нервная система (ЦНС) является иммунологически специализированным участком. Паренхима ЦНС, исключая ликворное пространство, мозговые оболочки и сосудистую сеть, классически рассматривается как иммунопривилегированный участок 1,2,3,4,5 и относительно лишена иммунных клеток в гомеостатических условиях ^2,6,7. Напротив, мозговые оболочки, состоящие из слоев твердой мозговой оболочки, арахноидального слоя и слоев мия, являются важнейшими компонентами компартмента ЦНС, активно участвуя в гомеостатическом иммунном надзоре и воспалительных процессах при патогенезе заболевания 3,6,7,8. В равновесном состоянии мозговые оболочки поддерживают многочисленные иммунные клетки, включая врожденные лимфоидные клетки (ILC), макрофаги, дендритные клетки (DC), тучные клетки, Т-клетки и, в меньшей степени, В-клетки ^9,10,11.

Мозговые оболочки представляют собой сильно васкуляризированные структуры и содержат лимфатические сосуды, обеспечивающие лимфатическую связь между ЦНС и ее периферией 8,12,13,14. При воспалительных состояниях, вызванных повреждением ЦНС, инфекциями, аутоиммунными заболеваниями или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки проникают в паренхиму и изменяют иммунный ландшафт в мозговых оболочках. После клеточной инфильтрации мозговые оболочки могут представлять собой функциональную нишу для периферических иммунных клеток, способствуя агрегации иммунных клеток, локальной активации иммунных клеток и длительному выживанию в компартменте ЦНС. Выраженное воспаление менингеальных оболочек наблюдается при множественных заболеваниях, поражающих ЦНС, включая рассеянный склероз (РС)15,16,17,18,19, инсульт 20,21, стерильные повреждения 22,23 (т.е. повреждение спинного мозга и черепно-мозговые травмы), мигрени 24 и микробную инфекцию ^25,26,^27,28,29. Таким образом, характеристика резидентных клеток и периферических иммунных клеток в менингеальном компартменте имеет важное значение для понимания роли этих клеток в стационарных условиях и патогенеза заболевания.

Извлечение головного, спинного мозга и мозговых оболочек из черепной коробки и тел позвонков является технически сложным и трудоемким процессом. В настоящее время не существует методов быстрого извлечения мозга с неповрежденными всеми тремя менингеальными слоями. Несмотря на то, что ламинэктомия дает превосходную морфологию тканей спинного мозга и сохраняет менингеальные слои, она чрезвычайно трудоемка и сложна^30,31. И наоборот, более традиционные методы экстракции, такие как извлечение головного мозга из черепной коробки и гидравлическая экструзия спинного мозга, способствуют быстрому извлечению ткани ЦНС, но при использовании этих методов утрачиваются как паутинные, так и твердые мозговые оболочки^30,31. Опущение твердой мозговой оболочки и паутинных слоев при обычном выделении тканей головного и спинного мозга приводит к неполному анализу клеток в компартменте ЦНС. Таким образом, идентификация новых методик, ориентированных на быстрое извлечение тканей ЦНС с интактными мозговыми оболочками, имеет решающее значение для оптимального анализа компартмента ЦНС.

В данной статье представлены два метода быстрого извлечения головного, спинного мозга и мозговых оболочек у мышей, облегчающие последующий анализ резидентных клеток и периферических иммунных клеток в паренхиме и мозговых оболочках ЦНС. Эти оптимизированные протоколы сосредоточены на 1) выделении одноклеточных суспензий для последующего анализа и 2) подготовке ткани к гистологической обработке. Получение одноклеточных суспензий из тканей головного мозга, спинного мозга, твердых мозговых и паутинных мозгов³² позволяет проводить одновременный анализ клеток, находящихся как в паренхиматозном, так и в менингеальном компартментах. Одноклеточные суспензии могут быть использованы в различных областях, включая анализ клеточных культур для стимуляции in vitro 33, иммуноферментное пятно (ELISpot)28,34,35, проточную цитометрию ^36,33 и одноклеточную ³⁷ или объемную транскриптомику. Кроме того, оптимизированный протокол декальцинации всего головного и спинного мозга с интактными черепами или позвоночными столбами, соответственно, позволяет мягко декальцинировать окружающую кость, оставляя мозговые оболочки нетронутыми и сохраняя морфологию тканей. Этот метод позволяет проводить селективную идентификацию белков или РНК с помощью методов иммуногистохимии (ИГХ) или гибридизации in situ (ISH) как в паренхимозном, так и в менингеальном пространствах. Характеристика фенотипа, состояния активации и локализации резидентных клеток и периферических иммунных клеток в ЦНС может предоставить информацию, необходимую для понимания того, как отдельные типы клеток в компартменте ЦНС вносят вклад в гомеостаз и патогенез заболевания.