チラピア湖ウイルスの特異的かつ迅速な検出のための逆転写ループ媒介等熱増幅(RT-LAMP)アッセイ

ティラピア湖ウイルス病(TiLVD)は、アジア^1、2、アフリカ、アメリカを含む世界の多くの地域でティラピアの死亡を引き起こすと伝えられているティラピア(^1,オロークロミス属)のウイルス性疾患です。この病気は、2009年にイスラエルでティラピアの大量死亡時に初めて認められ、キネレット湖の野生のティラピアの数^は年間257トンから8トンに劇的に急落した。この疾患は、チラピア湖ウイルス(TiLV)によって引き起こされ、これは、新しい属ティラピネウイルスおよび新種ティラピアチラピネウイルス³としてアムヌーンウイルス科に割り当てられている。TiLVの遺伝的特徴付^,けは、ウイルスが10タンパク質^,1、2、4をコードする10個のセグメントを有する新規なエンベロープ、陰¹性感覚、一本鎖RNAウイルスであることを示した。⁴セロロドン属のティラピアの様々な種、オレオクロミス、およびティラピンおよび他の温水魚(例えば、巨大なグーラ(オスフロネムス・ゴラミー))は^TiLV2,55の影響を受けやすいことが示²されている。現在、このウイルスは、感染した生きた魚^66、77の動きを通じて世界的に広がり続けているが、凍結チラピアまたはその製品を介したウイルス感染のリスクは⁸に制限されている。TiLV感染による実質的な死亡率は、ティラピア産業に著しく有害な経済的影響を及ぼす可能性がある。例えば、TiLV感染に伴うエジプトにおける夏の死亡率症候群の経済的影響は、1億米ドル9と計算された^。したがって、養殖場におけるこの病気の管理を容易にする迅速かつ適切な診断方法を開発することが重要である。

これまでTiLVDの診断は、分子アッセイ、ウイルス分離、組織病理学に基づいていました。TiLV診断^10,11,11用に異なるPCRプロトコルおよびプライマーが開発されている。例えば、ウイルスの検出感度を有するSYBRグリーンベースの逆転写定量PCR(RT-qPCR)法が開発され、TiLV検出¹⁰のために検証されている。TiLV 検出の他の PCR 法としては、TaqMan 定量 PCR¹¹、RT-PCR²、入れ子になった RT-PCR¹²、および半ネスト RT-PCR¹³が挙げられます。しかし、これらの方法は、反応の複雑さのために結果を生み出すために洗練された実験室機器と比較的長い時間を必要とし、フィールドアプリケーションには適していません。

ループ媒介アイソ熱増幅(LAMP)アッセイは、迅速でシンプルで実用的な分野アプリケーション^14,15,15です。この技術はストランド変位反応の原理を採用し、増幅反応は洗練された高価なサーマルサイクラー^14,15,15を使用せずに等温条件下で実行される。その結果、増幅されたLAMP製品またはRT-LAMP製品は、DNAまたは^RNA14の安全な可視化または濁度または白い沈殿物^{,16、17、18,17}の存在のために肉眼で観察するための蛍光染色を有するアガロースゲル電気泳動を用いてラダー状のバンドで分析される。¹⁸これらの理由から、この技術は、異なる魚病原体^,,,17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27のオンサイト検出に使用されています。^{20,21,22,17,18,19,26,27232425}本研究の目的は、TiLV検出のための迅速で敏感で正確なRT-LAMPアッセイを確立することであった。RT-LAMPアッセイは30分以内に魚のサンプルのTiLVのためのスクリーニングを提供する。この技術はTiLVDの診断および監視のために適用されるかもしれない。