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Abstract
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Immunologie und Infektion

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Published: May 18, 2020
doi:
10.3791/61025
, , , ,
1Department of Biotechnology, Faculty of Applied Science,King Mongkut’s University of Technology North Bangkok (KMUTNB), 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine,Kasetsart University, 3Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies,Kasetsart University, 4Department of Chemical and Process Engineering, The Sirindhorn Thai-German International Graduate School of Engineering (TGGS),King Mongkut’s University of Technology North Bangkok (KMUTNB)

Summary

Nous présentons un essai RT-LAMP pour la détection de TiLV chez le poisson tilapia à l’aide d’instruments simples sur une période de temps relativement courte par rapport aux techniques RT-PCR conventionnelles. Ce protocole peut aider à contrôler la propagation épidémique de TiLVD, en particulier dans les pays en développement.

Abstract

La maladie du virus du lac de Tilapia (TiLVD), une maladie virale émergente du tilapia causée par le virus du lac tilapia (TiLV), est un défi persistant dans l’industrie aquacole qui a entraîné la morbidité et la mortalité massives du tilapia dans de nombreuses régions du monde. Un essai diagnostique efficace, rapide et précis pour l’infection de TiLV est donc nécessaire pour détecter l’infection initiale et pour empêcher la propagation de la maladie dans l’agriculture aquacole. Dans cette étude, une méthode très sensible et pratique d’amplification isothermale (RT-LAMP) de transcription inverse très sensible et pratique est présentée pour détecter le virus du lac de tilapia dans les tissus du poisson. Une comparaison des essais RT-qPCR et RT-LAMP d’échantillons infectés a révélé des résultats positifs dans 63 (100%) et 51 (80,95%) échantillons, respectivement. En outre, une analyse des échantillons non infectés a montré que les 63 tissus non infectés ont donné des résultats négatifs pour les essais RT-qPCR et RT-LAMP. La réactivité croisée avec cinq agents pathogènes dans le tilapia a été évaluée à l’aide de RT-LAMP, et tous les tests ont montré des résultats négatifs. Les échantillons de foie et de mucus obtenus à partir de poissons infectés ont montré des résultats comparables en utilisant la méthode RT-LAMP, suggérant que le mucus peut être utilisé dans RT-LAMP comme un essai non létal pour éviter de tuer des poissons. En conclusion, les résultats ont démontré que l’essai RT-LAMP présenté fournit une méthode efficace pour la détection de TiLV dans le tissu de tilapia dans un rayon de 1 h. La méthode est donc recommandée comme outil de dépistage sur les fermes pour le diagnostic rapide de TiLV.

Introduction

La maladie par le virus du lac de Tilapia (TiLVD) est une maladie virale dans le tilapia(Oreochromis spp.) qui causerait des décès de tilapia dans de nombreuses régions du monde, y compris l’Asie1,2, l’Afrique et l’Amérique. La maladie a été identifiée pour la première fois lors de la mortalité massive du tilapia en 2009 en Israel, où le nombre de tilapia sauvage dans le lac Kinneret a chuté de façon spectaculaire, passant de 257 à 8 tonnes par an2. La maladie est causée par le virus du lac de tilapia (TiLV), qui a été attribué à la famille Amnoonviridae comme un nouveau genre Tilapinevirus et une nouvelle espèce Tilapia tilapinevirus3. La caractérisation génétique de TiLV a montré que le virus est un nouveau, négatif-sens, virus de l’ARN à brin unique qui a 10 segments codant 10 protéines1,2,4. Diverses espèces de tilapia dans le genre Sarotherodon, Oreochromis, et Tilapine et d’autres poissons d’eau chaude (par exemple, gourami géant (Osphronemus goramy))ont été montrés pour être sensibles à TiLV2,5. Actuellement, ce virus continue de se propager à l’échelle mondiale, peut-être par le mouvement de poissons vivants infectés6,7, tandis que le risque de transmission virale via le tilapia congelé ou son produit est limité8. La mortalité importante due à l’infection tiLV a le potentiel d’avoir un impact économique considérablement préjudiciable sur l’industrie du tilapia. Par exemple, l’impact économique du syndrome de mortalité estivale en Égypte associé à l’infection par tiLV a été estimé à 100 millions de dollarsEU 9. Par conséquent, il est important de mettre au point une méthode diagnostique rapide et appropriée pour faciliter le contrôle de cette maladie dans les exploitations piscicoles.

Jusqu’à présent, le diagnostic de TiLVD a été basé sur les essais moléculaires, l’isolement viral, et l’histopathologie. Différents protocoles PCR et amorces ont été développés pour le diagnostic TiLV10,11. Par exemple, une méthode quantitative PCR (RT-QPCR) basée sur le vert SYBR avec la sensibilité de détecter aussi peu que deux copies/L du virus a été développée et validée pour la détection TiLV10. D’autres méthodes PCR pour la détection TiLV comprennent TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, imbriqué RT-PCR12, et semi-niché RT-PCR13. Cependant, ces méthodes nécessitent un équipement de laboratoire sophistiqué et des périodes de temps relativement prolongées pour donner des résultats en raison de la complexité des réactions, ce qui les rend impropres à l’application sur le terrain.

L’essai d’amplification isothermale à médiation en boucle (LAMP) est une application rapide, simple et pratique pour le champ14,15. La technique utilise le principe d’une réaction de déplacement de brin, tandis que la réaction d’amplification fonctionne dans des conditions isothermales sans un cycleur thermique sophistiqué et coûteux14,15. Par conséquent, les produits LAMP amplifiés ou les produits RT-LAMP sont analysés dans des bandes en valeur d’échelle à l’aide d’électrophoresis gel agarose avec une tache fluorescente pour la visualisation sûre de l’ADN ou de l’ARN14 ou l’observation à l’œil nu pour la présence de turbidité ou d’un précipité blanc16,17,18. Pour ces raisons, cette technique a été utilisée pour la détection sur place de différents pathogènes du poisson17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Le but de cette étude était d’établir un essai rapide, sensible et précis de RT-LAMP pour la détection de TiLV. L’essai RT-LAMP offre un dépistage du TiLV dans des échantillons de poissons dans un délai de 30 min. La technique peut être appliquée pour le diagnostic et la surveillance de TiLVD.

Protocol

Cette expérience, qui portait sur l’utilisation de tissus animaux, a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Kasetsart, Bangkok, Thaïlande (numéro de protocole ACKU61-VET-009). 1. Collection de tissus Euthanasier les poissons tilapia à l’aide d’une surdose d’huile de clou de girofle (c.-à-d. plus de 3 ml/L). Le méthane tricaine peut être utilisé comme alternative à l’huile de clou de girofle. <…

Representative Results

Dans cette étude, un essai DE RT-LAMP a été développé pour détecter l’infection de TiLV dans le tilapia. Les échantillons testés ont été prélevés dans 14 fermes situées dans différentes parties de la Thaïlande entre 2015 et 2016. Les poissons infectés et non infectés ont été principalement regroupés en fonction des diagnostics physiques et des apparences de TiLVD symptomatique. L’infection de TiLV a été plus tard confirmée utilisant RT-PCR après le processus de collecte. L’électrophoresis d…

Discussion

L’industrie aquacole est continuellement menacée par des infections virales qui causent des pertes économiques importantes9,23,28. Par exemple, le TiLV émergent représente une menace majeure pour les pays producteurs de tilapia dans de nombreuses parties du monde1,6,9. Jusqu’à présent, il n’y avait pas de thérapeutique spé…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le projet est financé financièrement par le numéro de subvention du Fonds de recherche thaïlandais (TRF) RDG6050078 et le Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under the Higher Education Research Promotion et National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. La recherche est appuyée en partie par la bourse d’études supérieures de l’École supérieure de l’Université Kasetsart. Les auteurs tiens à remercier le Dr Kwanrawee Sirikanchana pour le récit parlant de la vidéo et Piyawatchara Sikarin pour l’édition de la vidéo.

Materials

Tissue collection:
Clove oil Better Pharma N/A
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) ThermoFisher Scientific Corp. 15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) Geneaid GZR100
Direct-zol RNA Kit: Zymo Research R2071
– Direct-zol RNA PreWash
– RNA Wash Buffer
– DNase/RNase-free water
– Zymo-spin IIICG columns
– Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer Biotechrabbit BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich 7487-88-9
dNTP set Bioline BIO-39053
Betaine Sigma-Aldrich B2629
Calcein mixture Merck 1461-15-0
Bst DNA polymerase Biotechrabbit BR1101301
AMV reverse transcriptase Promega M510A
Nuclease-free water Invitrogen 10320995
Elite dry bath incubator, single unit Major Science EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose Vivantis Technologies PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
– Tris Vivantis Technologies PR0612-1KG
– Acetic acid (glacial), EMSURE Merck Millipore 1000632500
– Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec Sigma-Aldrich V800170-500G
Neogreen NeoScience Co., Ltd. GR107
DNA gel loading dye (6X) ThermoFisher Scientific Corp. R0611
DNA ladder and markers Vivantis Technologies PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) Bio-Rad 1704487
PowerPac HC power supply Bio-Rad 1645052
Gel Doc EZ System Bio-Rad 1708270
UV sample tray Bio-Rad 1708271
NαBI imager Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis Technologies cDSK01 An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) ThermoFisher Scientific Corp. ND-2000
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725120
Nuclease-free water, sterile water MultiCell 809-115-CL
8-tube PCR strips, white Bio-Rad TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical Bio-Rad TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors N/A
Forceps N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer) Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60 LioFuge CM610
Corning LSE mini microcentrifuge Corning 6765
Pipettes Rainin Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips Quality Scientific Plastics TF series
Corning Isotip filtered tips Merck CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST Wuxi NEST Biotechnology 615601
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Referenzen

  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  3. Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
  4. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
  5. Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
  6. Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
  7. Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
  8. Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
  9. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
  10. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  11. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
  12. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  13. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
  15. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
  16. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
  17. Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
  18. Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
  19. Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
  20. Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
  21. Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
  22. Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
  23. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
  24. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
  25. Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
  26. Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
  27. Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
  28. Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Entwicklungsbiologie. 121, 255-261 (2005).
  29. Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
  30. Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
  31. Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
  32. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  33. Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
  34. Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
  35. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
  36. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  37. Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
  38. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  39. Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).

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Phusantisampan, T., Rawiwan, P., Roy, S. R. K., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus. J. Vis. Exp. (159), e61025, doi:10.3791/61025 (2020).
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