Summary

マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送

Published: May 05, 2020
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Summary

軸索輸送は運動ニューロンの健康にとって重要なメカニズムです。このプロトコルでは、マイクロ流体室を用いた運動ニューロン軸索における酸性コンパートメントおよびミトコンドリアの軸索輸送を追跡するための詳細な方法を提供する。

Abstract

運動ニューロン(MNs)は非常に長い軸索を持つ極偏光細胞です。軸索輸送はMNの健康にとって重要なメカニズムであり、神経の成長、発達、生存に寄与する。MN軸索における蛍光標識されたオルガネラの軸索輸送を追跡するためのマイクロ流体室(MFC)の使用法について詳細に説明する。この方法は、迅速で、比較的安価であり、空間および時間における細胞内の手がかりの監視を可能にする。我々は、ステッププロトコルをステップごとに記述する:1)ポリジメチルシロキサン(PDMS)の製造;2) MFCにおける腹側脊髄外植体およびMN解心培養のめっき;3)ミトコンドリアと酸性コンパートメントの標識後に生きた共焦点想像;4)手動および半自動軸索輸送分析。最後に、HB9:::GFP腹側脊髄外型軸索の輸送におけるHB9::GFP腹側脊髄の輸送の違いをシステムの有効性の証拠として示す。全体として、このプロトコルは、様々な軸索成分の軸索輸送を研究するための効率的なツールと、空間的実験的可能性を発見するのに役立つMFCの使用のための簡略化されたマニュアルを提供します。

Introduction

MNsは長い軸索を持つ非常に偏光細胞であり、成人の人間では最大1メートルに達する。この現象は、MN 接続性と機能の維持に重要な課題を生み出します。その結果、MNsは、細胞体からシナプスおよび背中への軸索に沿った情報、オルガネラ、および材料の適切な輸送に依存しています。タンパク質、RNA、オルガネラなどの様々な細胞成分は、軸索を介して定期的にシャトルされます。ミトコンドリアは、日常的にMNsで輸送される重要なオルガネラである. ミトコンドリアは、ATPの提供、カルシウムバッファリング、およびシグナリングプロセス11、22を担当するMNsの適切な活動および機能に不可欠である。ミトコンドリアの軸索輸送は、よく研究されたプロセス33、44です。興味深いことに、ミトコンドリア輸送における欠陥は、いくつかの神経変性疾患、特にMN疾患5に関与することが報告された。酸性コンパートメントは、MN軸索に沿って移動する固有のオルガネラの別の例として機能します。酸性コンパートメントは、リソソーム、エンドーソーム、トランスゴルジ装置、および特定の分泌小胞6を含む。酸性コンパートメントの軸索輸送の欠陥は、いくつかの神経変性疾患にも7で発見され、最近の論文はMN疾患におけるその重要性を強調した8。

効率的に軸索輸送を研究するために、体性および軸索コンパートメントを分離するマイクロ流体室は、多くの場合、9、1010使用しています。マイクロ流体システムの2つの大きな利点と、区分化と軸索の単離は、細胞内プロセス11の研究に理想的である。神経細胞体と軸索の間の空間的分離は、異なる神経区画(例えば、軸索対ソーマ)の細胞外環境を操作するために使用することができる。生化学的、神経細胞の成長/変性、免疫蛍光アッセイはすべてこのプラットフォームから恩恵を受けます。MFCはまた、骨格筋12、13、14,13,14などの他の細胞タイプとニューロンを協調させることによって、細胞間コミュニケーションの研究を支援することができる。

ここでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメント輸送を監視するための、シンプルでありながら正確なプロトコルについて述べています。さらに、逆行性および前向き移動小器官の相対的な割合と輸送速度の分布を比較することによって、この方法の使用を示す。

Protocol

このプロトコルでの動物のケアと治療は、テルアビブ大学動物倫理委員会の監督と承認の下で行われました. 1. MFCの準備 一次金型での PDMS 鋳造 (図 1) 詳細なプロトコル9に従って、一次金型(ウェーハ)を購入または作成します。 加圧空気を使用して、コーティングステップに進む前にウェハプラットフォームか…

Representative Results

記載されたプロトコルに従って、マウス胚性HB9::GFP脊髄外植体をMFCで培養した(図4A)。エクスプラントは、軸索が完全に遠位コンパートメントに交差したときに、7日間成長しました。ミトトラッカーディープレッドとライソトラッカーレッド染料は、ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付けるために遠位および近位コ?…

Discussion

本プロトコルでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメントの軸索輸送を追跡するシステムについて述べている。この簡素化されたin vitroプラットフォームにより、細胞下の神経区画の精密な制御、監視、操作が可能になり、運動ニューロン局所機能の実験的解析が可能になります。このプロトコルは、ALSなどのMN疾患を研究するのに有用であり、疾患<sup class="xre…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、イスラエル科学財団(ISF、561/11)と欧州研究評議会(ERC、309377)からの助成金によって支えられました。

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

Referenzen

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Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

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