Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche
Summary
Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute dei motoneuroni. In questo protocollo forniamo un metodo dettagliato per tracciare il trasporto assonale di compartimenti acidi e mitocondri negli assoni dei motoneuroni utilizzando camere microfluidiche.
Abstract
I motoneuroni (MN) sono cellule altamente polarizzate con assoni molto lunghi. Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute di MN, contribuendo alla crescita neuronale, allo sviluppo e alla sopravvivenza. Descriviamo un metodo dettagliato per l’uso di camere microfluidiche (MFC) per il monitoraggio del trasporto assonale di organelli etichettati fluorescenti negli assoni MN. Questo metodo è rapido, relativamente poco costoso, e consente il monitoraggio di segnali intracellulari nello spazio e nel tempo. Descriviamo un protocollo passo dopo passo per: 1) Fabbricazione di MFC polidimetilsiloxane (PDMS); 2) placcatura degli esanti del midollo spinale ventrale e coltura dissociata MN nelle MFC; 3) Etichettatura dei mitocondri e dei compartimenti acidi seguita dall’immaginazione confocale viva; 4) Analisi manuale e semiautomatica del trasporto assonale. Infine, dimostriamo una differenza nel trasporto di mitocondri e compartimenti acidi di HB9::GFP del midollo spinale ventrale degli assoni explant come prova della validità del sistema. Complessivamente, questo protocollo fornisce uno strumento efficiente per studiare il trasporto assonale di vari componenti assonali, nonché un manuale semplificato per l’utilizzo di MFC per aiutare a scoprire le possibilità spaziali sperimentali.
Introduction
Le MN sono cellule altamente polarizzate con lunghi assoni, che raggiungono fino a un metro di lunghezza negli esseri umani adulti. Questo fenomeno crea una sfida critica per il mantenimento della connettività e della funzione MN. Di conseguenza, le MN dipendono da un corretto trasporto di informazioni, organelli e materiali lungo gli assoni dal loro corpo cellulare alla sinapsi e alla schiena. Vari componenti cellulari, come proteine, RNA e organelli, vengono trasportati regolarmente attraverso gli assoni. I mitocondri sono organelli importanti che vengono regolarmente trasportati in MN. I mitocondri sono essenziali per la corretta attività e funzione delle MN, responsabili della fornitura ATP, del buffering del calcio e dei processi di segnalazione1,2. Il trasporto assonale dei mitocondri è un processo ben studiato3,4. È interessante notare che, difetti nel trasporto mitocondriale sono stati segnalati per essere coinvolti in diverse malattie neurodegenerative e in particolare nelle malattie MN5. I compartimenti acidi servono come un altro esempio per gli organelli intrinseci che si muovono lungo gli assoni MN. I compartimenti acidi includono lisosomi, endosomi, apparati trans-Golgi e alcune vescicle secretory6. I difetti nel trasporto assonale di compartimenti acidi sono stati riscontrati in diverse malattie neurodegenerative e7, e recenti documenti sottolineano la loro importanza nelle malattie MN8.
Per studiare in modo efficiente il trasporto assonale, le camere microfluidiche che separano i compartimenti somatici ed assonali sono spesso utilizzate9,10. I due vantaggi significativi del sistema microfluidico, e la compartimentazione e l’isolamento degli assoni, lo rendono ideale per lo studio dei processi subcellulari11. La separazione spaziale tra i corpi cellulari neuronali e gli assoni può essere utilizzata per manipolare gli ambienti extracellulari di diversi compartimenti neuronali (ad esempio, assoni contro soma). Biochimica, crescita/degenerazione neuronale e immunofluorescenza attraggono tutti i benefici di questa piattaforma. Le MFC possono anche aiutare a studiare la comunicazione tra cellule coculcolando neuroni con altri tipi di cellule, come i muscoli scheletrici12,13,14.
Qui, descriviamo un protocollo semplice ma preciso per il monitoraggio dei mitocondri e del trasporto dei compartimenti acidi nei motoneuroni. Mostriamo inoltre l’uso di questo metodo confrontando la percentuale relativa di organelli mobili retrogradi e anterogradili, nonché la distribuzione della velocità di trasporto.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo un sistema per monitorare il trasporto assonale di mitocondri e compartimenti acidi nei motoneuroni. Questa piattaforma in vitro semplificata consente un controllo preciso, il monitoraggio e la manipolazione dei compartimenti neuronali subcellulari, consentendo l’analisi sperimentale delle funzioni locali dei motoneuroni. Questo protocollo può essere utile per studiare malattie MN come la SLA, per concentrarsi sulla comprensione del meccanismo sottostante di disfunzione del trasporto as…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Israel Science foundation (ISF, 561/11) e del Consiglio europeo della ricerca (ERC, 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
Referenzen
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