Summary

Biologische monsters voorbereiding voor soortvorming bij cryogene temperatuur met behulp van hoge-resolutie röntgenabsorptiespectroscopie

Published: May 27, 2022
doi:

Summary

Dit protocol presenteert een gedetailleerde procedure om biologische cryosamples voor synchrotron-gebaseerde röntgenabsorptiespectroscopie-experimenten voor te bereiden. We beschrijven alle stappen die nodig zijn om de monstervoorbereiding en cryopreservatie te optimaliseren met voorbeelden van het protocol met kanker- en fytoplanktoncellen. Deze methode biedt een universele standaard voor cryo-voorbereiding van monsters.

Abstract

De studie van elementen met röntgenabsorptiespectroscopie (XAS) is van bijzonder belang bij het bestuderen van de rol van metalen in biologische systemen. Monstervoorbereiding is een belangrijke en vaak complexe procedure, met name voor biologische monsters. Hoewel röntgenspeciatietechnieken veel worden gebruikt, is er nog geen gedetailleerd protocol verspreid voor gebruikers van de techniek. Verder is chemische toestandsmodificatie van belang en worden cryo-gebaseerde technieken aanbevolen om de biologische monsters in hun bijna-inheemse gehydrateerde toestand te analyseren om het maximale behoud van de chemische integriteit van de cellen of weefsels te bieden. Hier stellen we een cellulair voorbereidingsprotocol voor op basis van cryo-geconserveerde monsters. Het wordt aangetoond in een hoge energie resolutie fluorescentie gedetecteerdE röntgenabsorptie spectroscopie studie van selenium in kankercellen en een studie van ijzer in fytoplankton. Dit protocol kan worden gebruikt met andere biologische monsters en andere röntgentechnieken die door bestraling kunnen worden beschadigd.

Introduction

De studie van de cellulaire biotransformaties van essentiële of toxische elementen vereist soortvormingstechnieken met een hoge gevoeligheid en moet monstervoorbereidingsstappen minimaliseren die vaak vatbaar zijn voor modificatie van chemische soorten.

Fysiologische elementen zoals selenium en ijzer staan erom bekend bijzonder moeilijk te specificeren zijn vanwege hun complexe chemie, verschillende stabiliteiten van de selenium- of ijzersoorten en hun lage concentratie in het ppm (mg / kg) of zelfs sub-ppm-bereik. De studie van de soortvorming van deze elementen door XAS kan dus uiterst uitdagend zijn. Synchrotron XAS en met name hoge energie resolutie fluorescentie gedetecteerde XAS (HERFD-XAS), die een zeer lage signaal-tot-achtergrondverhouding1 mogelijk maakt, zijn beschikbaar bij synchrotronbronnen om sterk verdunde elementen in complexe biologische matrices te speciëren 2,3. Conventionele fluorescentie-XAS-metingen kunnen worden uitgevoerd met behulp van een energy resolved solid state detector (SSD) met een energiebandbreedte ~ 150-250 eV, op de CRG-FAME-bundellijn bij de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, terwijl HERFD-XAS-metingen een kristalanalysatorspectrometer (CAS) nodig hebben, met een energiebandbreedte ~ 1-3 eV, op de CRG-FAME-UHD-bundellijn op de ESRF2 . Fluorescentiefotonen worden gediscrimineerd met betrekking tot hun energie met respectievelijk elektronische of optische processen.

De cryopreparaat van het monster is essentieel om structuren te behouden en de chemische integriteit van de samenstelling te behouden, waardoor analyse dicht bij de biologische inheemse toestand5 mogelijk is. Bovendien zorgen analyses uitgevoerd bij cryogene temperaturen zo laag als 10 K met behulp van vloeibare helium cryogene koeling (LN2), ervoor dat stralingsschade vertraagt en elementaire speciatie voor XAS behoudt. Hoewel sommige beoordelingen van XAS-technieken toegepast op biologische monsters de noodzaak melden om monsters in cryogene omstandigheden voor te bereiden en te analyseren (bijv. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beschrijft geen van hen duidelijk het gerelateerde gedetailleerde protocol. In deze publicatie wordt een methode beschreven voor cryo-voorbereiding van kankercellen en planktonmicro-organismen voor HERFD-XAS-speciatie van Se8 en Fe9 bij cryogene temperatuur.

Goede praktijken voor monstervoorbereiding en omgeving tijdens state-of-the-art XAS-spectroscopiemetingen vereisen 1) een opstelling; 2) een analyseprocedure die de effecten van stralingsschade zoveel mogelijk beperkt; en 3) een monster (of model samengestelde referentie) dat zo homogeen mogelijk is ten opzichte van de bundelgrootte van röntgenfotonen. Het eerste item wordt in aanmerking genomen door de acquisitie bij een lage temperatuur uit te voeren, met behulp van een vloeibare helium cryostaat. Het tweede item wordt behandeld door elke acquisitie uit te voeren op een vers deel van het monster door het ten opzichte van de balk te verplaatsen. Ten slotte worden, rekening houdend met de derde voorwaarde, monsters (pellets) en referenties (poeders) geconditioneerd in geperste bulkpellets om porositeiten en inhomogeniteiten zoveel mogelijk te beperken en ruwheid te voorkomen met betrekking tot de bundelgrootte op het oppervlak van het röntgensonde monster. We leggen uit hoe het protocol met al deze punten omgaat.

We gebruikten menselijke prostaatcellijn PC-3 (hoog gemetastaseerd potentieel) en ovariumcellijn OVCAR-3 (die goed is voor maximaal 70% van alle gevallen van eierstokkanker) om de antiproliferatieve eigenschappen ten opzichte van kankercellen van selenium nanodeeltjes (Se-NP’s) en Phaeodactylum tricornutum diatomeeën te onderzoeken als een modelsoort om ijzervastlegging in fytoplankton te onderzoeken.

Protocol

1. Bereiding van de menselijke PC-3 en OVCAR-3 kankercelkorrels voor seleniumspeciatie OPMERKING: Het volgende protocol is aangepast van Weekley et al.10. Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een celkweekkap onder bioveiligheidsniveau 2-omstandigheden en -beperkingen, met behulp van aseptische technieken. Tel de cellen met behulp van een Malassez-celtelkamer. Zaad 150.000-200.000 cellen per kolf voor de PC-3 cellijn en 300.000 cellen voor de OVCAR-3 cel…

Representative Results

De belangrijkste doelen van deze preparaten waren het onderzoeken van de interactie tussen selenium nanodeeltjes (Se-NP’s) en kankercellen, en ijzerbinding en sekwestratie in fytoplankton. HERFD-XANES spectra van het selenium in de begintoestand (BSA Se-NP’s) en in cellen geïncubeerd in voedingsmedium (BSA Se-NP’s na 24 uur incubatie) zijn weergegeven in figuur 10. De resultaten toonden aan dat selenium in de initiële Se-NP’s aanwezig was als zowel Se(0)</s…

Discussion

Dit protocol werd gebruikt om de chemische vorm van selenium en ijzer in biologische monsters te bestuderen door middel van röntgenabsorptiespectroscopie. Het richt zich op de cryo-voorbereiding en opslag van biologische monsters en referentieverbindingen, evenals op de HERFD-XAS-metingen.

Cryo-voorbereiding en opslag
De cryo-voorbereiding van de bulk biologische monsterkorrels maakt het mogelijk om de chemische integriteit van de in de monsters aanwezige soorten te behoud…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn dankbaar voor de financiële bijdragen aan de ontwikkeling van de beamline door CEMHTI (Orleans, Frankrijk, ANR-13-BS08-0012-01) en Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrijk, ANR-10-LABX-0056). Het FAME-UHD-project wordt financieel ondersteund door het Franse “grand emprunt” EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), het CEA-CNRS CRG-consortium en het INSU CNRS-instituut. We zijn dankbaar voor alle bijdragen tijdens de experimenten, vooral alle personen die aan BM30B en BM16 werken. De auteurs erkennen de European Synchrotron Radiation Facility voor het leveren van synchrotron stralingsbundeltijd. We erkennen ook het PHYTOMET ANR-project voor financiële steun (ANR-16-CE01-0008) en het SEDMAC-project voor financiële steun (INCA-Plan kanker-ASC16019CS).

Materials

Ammonium nitrate Sigma-Aldrich A3795 NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber Coy Laboratory, USA equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock Sigma-Aldrich A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder Sigma-Aldrich 255475
Cell counting chamber Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO 14190-094 Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes 0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes 15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 Sigma-Aldrich F3388 aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum GIBCO A31604-02 Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks Sigma-Aldrich Z707503 TPP 150 cm2 area
Growth chamber Sanyo Sanyo MLR-352 at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer Sigma-Aldrich H4034 1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3 ATCC, Rockville, MD HTB-161 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas Sigma-Aldrich I0516 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum Roscoff culture collection RCC69 http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid Sigma-Aldrich M3183 MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3 ECCAC, Salisbury, UK 90112714 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts Sigma-Aldrich S9883 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers Oxford Instrument AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) GIBCO A10491-01 Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA Se50-BS-1 BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA 11. Se50-CS-1 Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate Sigma-Aldrich 71746 Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate Sigma-Aldrich S5022 NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock Sigma-Aldrich M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%) GIBCO 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25300-054
Vitamin stock Sigma-Aldrich T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C

Referenzen

  1. Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
  2. Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
  3. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  4. Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
  5. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
  6. Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  7. Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
  8. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018)
  9. Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemie. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  10. Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
  11. Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
  12. SSHADE: “Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise” and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: https://www.sshade.eu/ (2018)
  13. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  14. Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
  15. Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
  16. Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
  17. Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
  18. Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
  19. Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
  20. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019)
  21. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Bissardon, C., Isaure, M., Lesuisse, E., Rovezzi, M., Lahera, E., Proux, O., Bohic, S. Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution X-Ray Absorption Spectroscopy. J. Vis. Exp. (183), e60849, doi:10.3791/60849 (2022).

View Video