Summary

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo’s, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo’s en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Abstract

Het gebruik van genetisch gemodificeerde (GM) muizen is cruciaal geworden voor het begrijpen van de genfunctie en het ontcijferen van de onderliggende mechanismen van menselijke ziekten. Het CRISPR/Cas9-systeem stelt onderzoekers in staat om het genoom te wijzigen met ongekende efficiëntie, trouw en eenvoud. Gebruikmakend van deze technologie, onderzoekers zijn op zoek naar een snelle, efficiënte en eenvoudige protocol voor het genereren van GM muizen. Hier introduceren we een verbeterde methode voor cryopreservatie van eencellige embryo’s die leidt tot een hogere ontwikkelingsgraad van de invriesontdooide embryo’s. Door het te combineren met geoptimaliseerde elektroporatieomstandigheden, maakt dit protocol het mogelijk om binnen korte tijd knock-out- en knock-in muizen te genereren met een hoog rendement en lage mozaïeksnelheden. Verder tonen we een stapsgewijze uitleg van ons geoptimaliseerde protocol, dat betrekking heeft op CRISPR reagensvoorbereiding, in vitro fertilisatie, cryopreservatie en ontdooiing van eencellige embryo’s, elektroporatie van CRISPR-reagentia, muisgeneratie en genotypering van de oprichters. Met behulp van dit protocol moeten onderzoekers gm-muizen met ongeëvenaard gemak, snelheid en efficiëntie kunnen voorbereiden.

Introduction

Het geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeats (CRISPR)/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9) systeem is een wetenschappelijke doorbraak die ongekende gerichte modificatie in het genoom1biedt. Het CRISPR/Cas9 systeem bestaat uit Cas9 eiwit- en gidsRNA (gRNA) met twee moleculaire componenten: een doelspecifiek CRISPR RNA (crRNA) en een transactiverend CRISPR RNA (tracrRNA)2 . Een gRNA stuurt het Cas9-eiwit naar de specifieke locus in het genoom, 20 nucleotiden complementair aan crRNA en grenzend aan het protospacer aangrenzende motief (PAM). Het Cas9-eiwit bindt zich aan de doelsequentie en induceert dubbele strengbreuken (DSB’s) die worden gerepareerd door ofwel foutgevoelige nonhomologe end joining (NHEJ) of high fidelity homologie-gerichte reparatie (HDR)3,4,5. NHEJ leidt tot invoegingen of/en schrappingen (indels), en vandaar tot genverlies van functie wanneer een codageopeenvolging wordt gericht. De HDR leidt tot nauwkeurige genoombewerking in aanwezigheid van een reparatiesjabloon met homologiesequenties3,4,5. De NHEJ en HDR zijn ingezet om respectievelijk knock-out- en knock-in muizen te genereren.

Terwijl het CRISPR/Cas9-systeem de generatie GM-muizen met een uitstekende werkzaamheid en trouw aanzienlijk heeft versneld, stuiten wetenschappers die deze methoden toepassen vaak op technische uitdagingen. Ten eerste vereisen conventionele protocollen micro-injectie voor de introductie van de CRISPR-bewerkingsinstrumenten in de kern van bevruchte eieren6,7. Deze techniek is tijdrovend en vereist meestal uitgebreide training. Zo vervingen verschillende groepen micro-injectie door elektroporatie8,9,10,11,12,13. In de vroege elektroporatieprotocollen werden echter verse embryo’s gebruikt voor elektroporatie. Dit veroorzaakte een ander probleem, omdat het bereiden van verse embryo’s voor elk experiment moeilijk is14.

Onlangs hebben wij en anderen het gebruik van gevriesontdooide embryo’s en elektroporatie voor genoombewerking gecombineerd, wat de generatie gm-muizen15,16vergemakkelijkt. Dit protocol stelt onderzoekers zonder geavanceerde embryomanipulatievaardigheden in staat om snel diermodellen van menselijke ziekten met een hoge efficiëntie te genereren. Het protocol vermindert ook aanzienlijk praktische uitdagingen bij het genereren van GM muizen, zoals genetische heterogeniteit in de oprichters16. Om mosaicisme te overwinnen, voeren we de elektroporatie van CRISPR-reagentia uit binnen 1 uur na het ontdooien van embryo’s om ervoor te zorgen dat bewerking plaatsvindt vóór de eerste replicatie van het genoom. Een andere verbetering omvat het gebruik van Cas9-eiwit in plaats van Cas9 mRNA om ongewenst mozaïekisme te verminderen17. Verder ontwikkelden we een optimale methode voor eencellige embryo cryopreservatie die de ontwikkelingsgraad verhoogt tot de tweecellige fase16: het gebruik van foetaal runderserum (FBS) verbetert de overleving van vriesontdooide eicellen na de bevruchting drastisch, misschien door hetzelfde mechanisme dat bevriesde onbevruchte eicellen maakt18.

Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor de generatie van GM muizen met behulp van gevriesontdooide embryo’s, met inbegrip van de gewijzigde methode voor cryopreservatie van eencellige C57BL/6J embryo’s. Het omvat 1) gRNA-ontwerp, CRISPR reagensvoorbereiding en montage; 2) IVF, cryopreservatie en ontdooiing van embryo’s uit één cel; 3) Elektroporatie van CRISPR-reagentia in ontdooide embryo’s; 4) Embryotransfer in het eicel van pseudozwangere vrouwelijke muizen; en 5) Genotypering en sequentieanalyse van de F0-oprichtersdieren.

Protocol

Alle dierverzorging en procedures die in dit onderzoek werden uitgevoerd, werden uitgevoerd volgens de regels en voorschriften van de Gids voor de Zorg en Het Gebruik van Proefdieren. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Animal Care Committee of Laboratory Animals van de Universiteit van Toyama, de Universiteit van Tokio, de Jichi University en het Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Informatie over alle reagentia is te zien in de Materiaaltafel. 1. CR…

Representative Results

Onze gewijzigde methode voor cryopreservatie van eencellige embryo’s, inclusief incubatie in HTF met 20% FBS voor 10 min gevolgd door cryopreservatie in 1 M DMSO en DAP213 oplossing, verbeterde de ontwikkelingsgraad van de invriezen ontdooide embryo’s in de tweecellige fase (Figuur 1, p = 0,009, Student’s t-test). De ontdooide embryo’s werden gebruikt voor de productie van GM-muizen en elektroporratieomstandigheden werden geoptimaliseerd: vijf herhalingen van 25 V met 3 ms-pulsen en interval…

Discussion

Het beschreven protocol maakt het mogelijk voor de generatie van GM muizen met een hoog rendement en lage mozaïek tarieven (Tabel 1). Het stelt onderzoekers zonder geavanceerde embryomanipulatievaardigheden in staat om mutantmuizen gemakkelijk te maken omdat het gebruik maakt van de nieuwste en meest nuttige vooruitgang in zowel reproductieve engineering- als genoombewerkingstechnologieën: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) en elektroporatie in gevriesde embryo’s. Deze vooruitgang vergemakkelijkte en …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen Hitomi Sawada en Elizabeth Garcia bedanken voor de verzorging van dieren. Dit werk werd ondersteund door KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 en 16K01946) en Hokugin Research Grant (naar H.N.), en Jichi Medical University Young Investigator Award (naar H.U.). De Otsuka Toshimi Scholarship Foundation steunde MD.

Materials

0.25 M Sucrose ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) SUCROSE
1 M DMSO ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) 1M DMSO
Butorphanol Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1081060
C57BL/6J mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
DAP213 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) DAP213
FBS Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) ES-009-C
hCG MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) HCG Mochida 3000
HTF ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) HTF
ICR mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
Isoflurane Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) 07-893-1389
KSOM ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) KSOM
LN2 Tank Chart Industries (Ball Ground, GA) XC 34/18
M2 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) M2
Medetomidine Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) 1124401A1060
Microscope Nikon Co. (Tokyo, Japan) SMZ745T
Midazolam Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) 1124401A1060
Nuclease free buffer Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1072570
Nucleospin DNA extraction kit Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) 740952 .5
One-hole slide glass Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) S339929
One-step type Electroporator BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) CUY21EDIT II
Paraffin Liquid NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) SP 26137-85
Platinum plate electrode BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) LF501PT1-10, GE-101
PMSG ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) SEROTROPIN 1000
Povidone iodide Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) C12400
Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) 22600134
Two-step type Electroporator Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) NEPA21

Referenzen

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Entwicklungsbiologie. 393 (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
  9. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetik. 200 (2), 423-430 (2015).
  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  11. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  12. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  13. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  14. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  15. Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
  16. Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
  17. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Entwicklungsbiologie. 418 (1), 1-9 (2016).
  18. Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
  19. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  20. Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Biotechnik. 6 (3), 63 (2019).
  21. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
  22. Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
  23. Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
  24. Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
  25. Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
  26. Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
  27. Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
  28. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
  29. Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
  30. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  31. Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  32. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  33. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  34. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  35. Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Nishizono, H., Darwish, M., Uosaki, H., Masuyama, N., Seki, M., Abe, H., Yachie, N., Yasuda, R. Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice. J. Vis. Exp. (158), e60808, doi:10.3791/60808 (2020).

View Video