Summary

ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたゼブラフィッシュ胚におけるエタノール濃度の定量

Published: February 11, 2020
doi:

Summary

この研究は、適切な暴露方法から胚処理およびエタノール分析へのヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノールレベルを定量化するプロトコルを記述する。

Abstract

胎児アルコールスペクトル障害(FASD)は、顔面変形および神経障害を含むエタノール誘発発達欠陥の非常に可変的な連続体を記述する。複雑な病理を持つFASDは、毎年米国で生まれた約100人に1人の子供に影響を与えます。FASDの非常に可変的な性質のために、動物モデルはエタノール誘発開発欠陥の私達の現在の機械論的理解の重大な証明された。ゼブラフィッシュを使ってエタノールによる発達欠陥を調べることに焦点を当てた研究室が増えています。ゼブラフィッシュは、外部受精、遺伝的に引っ張り可能な半透明の胚を多数産生する。これにより、研究者は複数の遺伝的文脈でエタノール暴露のタイミングと投与量を正確に制御し、ライブイメージング技術を通じて胚性エタノール暴露の影響を定量化することができます。これは、遺伝学とヒトとの発達の両方の高度な保全と相まって、ゼブラフィッシュがエタノール催奇性の機械学的基礎を研究する強力なモデルであることが証明されている。しかし、エタノール暴露レジメンは、これらの研究全体でゼブラフィッシュデータの解釈を混乱させている異なるゼブラフィッシュ研究の間で変化している。ここでは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノール濃度を定量するプロトコルを示します。

Introduction

胎児アルコールスペクトル障害(FASD)は、胚性エタノール暴露1に関連する幅広い神経障害および頭蓋顔面異形について説明する。エタノール暴露および遺伝的背景のタイミングと投与量を含む複数の要因は、FASD2、3の変動に寄与する。人間では、これらの変数の複雑な関係は、FASDの病因を研究し、理解することは困難です。動物モデルは、エタノール催奇形性の機械論的基礎に関する我々の理解を深める上で極めて重要であることが証明されている。多種多様な動物モデルシステムがFASDの複数の側面を研究するために使用されており、結果はヒト4の暴露に見られるものと著しく一致している。げっ歯類モデルシステムは、マウスが最も一般的な5、6、7である、FASDの多くの側面を調べるために使用されます。この研究の大半は、初期エタノール暴露8に対する発達欠陥に焦点を当てているが、エタノールへの後の暴露は、同様に9の発達異常を引き起こすことが示されている。さらに、マウスの遺伝的能力は、FASD10,11の遺伝的基盤を調査する能力に大いに役立っています。マウスにおけるこれらの研究は、ソニックヘッジホッグ経路との遺伝子エタノール相互作用があることを強く示唆しています, レチノイン酸シグナル伝達,スーパーオキシドジスムターゼ, 一酸化窒素シンターゼI, Aldh2Fancd28,10, 11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21.これらの研究は、動物モデルがFASDとその根本的なメカニズムに関する我々の理解を進めるために重要であることを示している。

ゼブラフィッシュは、エタノールの多くの側面を調べる強力なモデルシステムとして登場しました22,23.外的受精、高い胎児性、遺伝的な管への影響、および生きている画像化能力のために、ゼブラフィッシュは、エタノールのテラトジェネシスのタイミング、投与量、遺伝学などの因子を研究するのに理想的です。エタノールは、正確にステージされた胚に投与することができ、胚を画像化して、発生過程におけるエタノールの直接的な影響を調べることができます。開発の遺伝的プログラムはゼブラフィッシュとヒトの間で高度に保存されているため、FASDのヒト研究を導くのに役立つため、この研究は、ヒトに直接関連することができます24.ゼブラフィッシュはエタノールのテラトジェネシスを調べるために使用されてきたが、胚エタノール濃度を報告する際のコンセンサスの欠如は、ヒトとの比較を困難にする25.哺乳類システムでは、血中アルコール濃度は組織エタノールレベル26に直接相関する。ゼブラフィッシュ研究の多くは、循環系の完全な形成前に胚を治療する。検査する母体試料が存在しない場合、胚内のエタノール濃度を定量化するにはエタノール濃度を評価するプロセスが必要です。ここでは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いて、現像するゼブラフィッシュ胚中のエタノール濃度を定量するプロセスについて説明する。

Protocol

この手順で使用されるすべてのゼブラフィッシュ胚は、確立されたIACUCプロトコル27に従って飼育および飼育された。これらのプロトコルは、テキサス大学オースティン校とルイビル大学によって承認されました。 注:ゼブラフィッシュラインTg(fli1:EGFP)y1は、この研究で使用されました28.この手順で使用されるすべての水?…

Representative Results

血中エタノール濃度は、完全に形成された循環系を欠いているため、初期の胚ゼブラフィッシュでは決定できません。ゼブラフィッシュ胚中のエタノール濃度のレベルを決定するために、エタノールレベルは均質化された胚組織から直接測定される。胚性エタノール濃度を適切に測定するには、胚量を考慮する必要があります。胚(卵黄付)は、胎児の体液で囲まれた絨毛膜(卵殻)の中に位置し…

Discussion

開発モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは環境要因が開発に及ぼす影響を研究するのに理想的です。彼らは、エタノール研究で正確なタイミングと投与パラダイムを可能にする外部受精胚の多数を生成します。これは、ライブイメージング能力と人間との遺伝的および発達的保全と組み合わせることで、ゼブラフィッシュを気象学研究のための強力なモデルシステムにします。記載さ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この記事で発表された研究は、国立衛生研究所/国立歯科頭蓋顔面研究所(NIH/NIDCR)R01DE020884からJ.K.E.への以前の助成金によって支えられていました。 国立衛生研究所/アルコール乱用・アルコール依存症研究所(NIH/NIAAA)F32AA021320からC.B.L.への、国立衛生研究所/国立アルコール乱用研究所(NIH/NIAAA)R00AA023560からC.B.L.ガスクロマトグラフ分析を提供し、支援してくれたルーベン・ゴンザレスに感謝します。ティアナ・オンティヴェロスとジーナ・ノーブルズ博士の執筆支援に感謝します。

Materials

Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

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Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

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