Utilizzo degli embrioni di pesce zebra Tg(Vtg1:mcherry) per testare gli effetti estrogenici dei composti interferenti endocrini

C’è un numero significativo di composti interferenti endocrini (EDC) che sono tra le sostanze più pericolose nel nostro ambiente. Questi sono principalmente composti estrogenici che contaminano l’acqua dalle risorse naturali. La diversità chimica delle sostanze appartenenti al gruppo rende difficile la verifica della loro presenza, in quanto sono necessari diversi metodi analitici per la loro rilevazione. Sulla base della loro struttura chimica è molto difficile determinare se una sostanza è effettivamente in grado di agire come un estrogeno. Inoltre, queste sostanze non sono mai presenti in forma pura nell’ambiente, quindi i loro effetti possono essere influenzati da altri composti, troppo¹. Questo problema può essere risolto con metodi di rilevamento degli effetti, come l’uso di organismi biomonitor/bioindicator che mostrano effetti estrogenici^2,3,4,5.

Recentemente, una varietà di linea cellulare⁶ e sistemi di test a base di lievito^2,3 sono stati sviluppati per rilevare gli effetti estrogenici. Tuttavia, questi sono generalmente solo in grado di rilevare il legame della sostanza al recettore estrogeno^2,3. Inoltre, non sono in grado di modellare processi fisiologici complessi nell’organismo o di rilevare fasi ormone-sensibili delle fasi della vita; così, spesso portano a risultati falsi.

È noto che alcuni geni reagiscono in modo sensibile agli estrogeni negli organismi viventi⁷. La rilevazione di prodotti genici mediante metodi di biologia molecolare è possibile anche a livello di proteina o mRNA^8,9, ma di solito comporta il sacrificio animale. Le leggi sulla protezione degli animali sono diventate più severe e vi è una crescente domanda di sistemi di prova alternativi che riducano al minimo il numero e la sofferenza degli animali utilizzati negli esperimenti o nella sostituzione del modello animale con un altro sistema modello¹⁰. Con la scoperta delle proteine fluorescenti e la creazione di linee di biomarcatori, le tecnologie transgeniche forniscono una buona alternativa¹¹. Con queste linee, l’attivazione di un gene estrogeno-sensibile può essere testata in vivo.

Tra i vertebrati, il potenziale dei pesci nella valutazione del rischio ambientale è eccezionale. Offrono molti vantaggi rispetto ai modelli di mammiferi: essendo organismi acquatici, sono in grado di assorbire gli inquinanti attraverso tutto il loro corpo, produrre un gran numero di prole, e alcune delle loro specie sono caratterizzate da tempi di breve generazione. Il loro sistema endocrino e i processi fisiologici mostrano grandi somiglianze con altri vertebrati e anche con i mammiferi, compresi gli esseri umani¹².

Diversi geni per il rilevamento degli effetti estrogenici nei pesci sono noti anche. I più importanti sono i recettori degli estrogeni aromatasi-b, choriogenin-H, e vitellogenina (vtg)^7,13. Recentemente, sono state create diverse linee di biosensori che producono estrogeni anche da modelli di pesce utilizzati in laboratorio, come dal pesce zebra (Danio rerio)^{4,5,14,15,16,17}. Il vantaggio principale del pesce zebra nella creazione di linee biosensori è il corpo trasparente degli embrioni e delle larve, perché il segnale fluorescente del reporter può quindi essere facilmente studiato in vivo senza sacrificare l’animale¹⁰. Oltre alla protezione degli animali, è anche una caratteristica preziosa in quanto consente di studiare la reazione dello stesso individuo in diversi momenti del trattamento¹⁸.

Questi esperimenti utilizzano una vitellogenina reporter transgenico zebrafish line¹⁵. Il costrutto transgene utilizzato per lo sviluppo di Tg(vtg1:mCherry) ha un lungo (3,4 kbp) promotore di vitellogenina-1 naturale. Il recettore degli estrogeni (ER) è una proteina potenziatore attivata dai ligando che è un rappresentante della superfamiglia di recettori steroide/nucleare. ER si lega a sequenze specifiche di DNA chiamate elementi di risposta degli estrogeni (ERE) con alta affinità e trasattiva l’espressione genica in risposta a estradiolo e altre sostanze estrogeniche, quindi più ERE nel promotore provoca una risposta più forte¹⁹. Ci sono 17 siti ERE nella regione promotrice del costrutto transgene Tg(vtg1:mCherry) e si prevede che imitano l’espressione del gene nativo vtg¹⁵. C’è un’espressione continua del segnale fluorescente nelle femmine sessualmente maturate. Tuttavia, nei maschi e nell’embrione l’espressione nel fegato è visibile solo dopo il trattamento con sostanze estrogeniche (Figura 1).

Figura 1: segnale fluorescente rosso nel fegato del pesce zebra adulto transgenico mcherry e 5 embrioni dpf, dopo l’induzione di 17-estradiolo (E2). Nella femmina e nel maschio trattata con E2 (tempo di esposizione E2:48 ore) la forte fluorescenza del fegato è visibile anche attraverso la pelle pigmentata. Nessun segnale fluorescente è visibile nel maschio non trattato (A). Dopo l’induzione di E2 (50 g/L tempo di esposizione: 0-120 hpf), si può osservare anche un segnale fluorescente rosso nel fegato di 5 embrioni dpf, che non è visibile negli embrioni di controllo (B). Mentre il segnale fluorescente è continuamente presente nelle femmine adulte, principalmente i maschi e gli embrioni della linea sono adatti per rilevare gli effetti estrogenici. (BF: campo luminoso, mCherry: visualizzazione filtro fluorescente rosso, singole immagini semplici, barra della scala A: 5mm, barra della scala B: 250 m) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Simile alla vitellogena endogena, il reporter mCherry è espresso solo nel fegato. Poiché la vitellogenina viene prodotta solo in presenza di estrogeni, non c’è segnale fluorescente nei controlli. Poiché l’espressione è solo nel fegato, la valutazione dei risultati è molto più facile¹⁵.

La sensibilità e l’usabilità degli embrioni di questa linea sono state studiate su varie miscele composte estrogeniche e anche su campioni ambientali^15,20e nella maggior parte dei casi sono state documentate relazioni dose-risposta (Figura 2). Tuttavia, nel caso di sostanze altamente tossiche, principalmente epatossiche (ad esempio, zearalenone), solo un segnale fluorescente molto debole può essere visibile nel fegato degli embrioni trattati e il segnale fluorescente massimo causato dall’interno di una gamma di concentrazione molto piccola, il che rende difficile stabilire relazioni effetto dose²⁰.

Figura 2: Diagramma dose-risposta (A) e immagini fluorescenti (mCherry) del fegato (B) esposte a 17-ethynilestradiol (EE2), in 5 dpf vtg1:mCherry larve. I risultati sono espressi come densità integrata generata dalla forza del segnale e dalle dimensioni dell’area interessata (SEM, n – 60). 100% si riferisce al massimo osservato. L’intensità del segnale fluorescente è aumentata gradualmente con la concentrazione. Barra di scala 250 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ci sono diverse sostanze estrogeniche presenti nell’ambiente, ad esempio 17-estradiolo (concentrazione ambientale: 0,1–5,1 ng/L)²¹, 17-ethynylestradiol (concentrazione ambientale: 0,16–0,2^{2 ,}zearalenone (concentrazione ambientale: 0,095–0,22 g/L)²³, bisfenolo-A (concentrazione ambientale: 0,45–17,2 mg/L)²⁴. Durante il test di queste sostanze in forma puramente attiva con l’aiuto di embrioni transgenici mCherry, le concentrazioni di effetti più basse osservate (LOEC) per il rilevamento dei segni fluorescenti erano 100 ng/L per 17-estradiol, 1 ng/L per il trattamento 17-ethynilestradiol, 100 ng/L per zearalenone e 1 mg/L per il trattamento bisfenolo-A (96–120 hpf), che è molto vicino o all’interno della gamma di concentrazioni ambientali delle sostanze¹⁵. La linea transgenica Tg(vtg1:mCherry) può aiutare a rilevare l’estrogenità nei campioni di acque reflue dopo l’esposizione diretta. La linea è sensibile come il test estrogeno lievito comunemente usato, l’estrogeno lievito bioluminiscente (BLYES) assay¹⁵. Con l’aiuto di questa linea, gli effetti protettivi di beta-ciclodextrins contro la tossicità indotta da zearalenone sono stati confermati utilizzando miscele chimiche²⁰.

In un recente rapporto, l’uso in vivo della linea transgenica è stato dimostrato con l’aiuto di due metaboliti estrogenici zearalenone (EA) ,²⁵e zearalenolo . La linea di base del protocollo è appropriata per studiare gli effetti estrogenici di diversi composti o campioni ambientali sugli embrioni Tg(vtg1:mCherry).