Met behulp van Tg (Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryo's om de oestrogene effecten van endocriene verstorende verbindingen te testen

Er is een aanzienlijk aantal hormoonontregelende verbindingen (EDC) die tot de gevaarlijkste stoffen in ons milieu behoren. Dit zijn voornamelijk oestrogene verbindingen die water uit natuurlijke hulpbronnen vervuilen. De chemische diversiteit van de stoffen die tot de groep behoren, maakt het testen op hun aanwezigheid moeilijk, aangezien verschillende analysemethoden nodig zijn voor de detectie ervan. Op basis van hun chemische structuur is het zeer moeilijk om te bepalen of een stof daadwerkelijk in staat is om op te treden als een oestrogeen. Bovendien zijn deze stoffen nooit in zuivere vorm in het milieu aanwezig, dus de effecten ervan kunnen ook door andere verbindingen worden beïnvloed¹. Dit probleem kan worden opgelost door effectdetectiemethoden, zoals het gebruik van biomonitor/bio-indicatororganismen die oestrogene effecten vertonen^2,3,4,5.

Onlangs is een verscheidenheid van cellijn⁶ en gist-gebaseerde testsystemen^2,3 ontwikkeld om oestrogene effecten te detecteren. Deze zijn echter over het algemeen alleen in staat om de binding van de stof aan de oestrogeenreceptor^2,3op te sporen . Bovendien zijn ze niet in staat om complexe fysiologische processen in het organisme te modelleren, of om hormoongevoelige fasen van levensfasen op te sporen; ze leiden dus vaak tot valse resultaten.

Het is bekend dat bepaalde genen gevoelig reageren op oestrogeen in levende organismen⁷. De detectie van genproducten door moleculaire biologie methoden is ook mogelijk op het eiwit of mRNA niveau^8,9, maar meestal gaat het om dierenoffers. De wetgeving inzake dierenbescherming is strenger geworden en er is een groeiende vraag naar alternatieve testsystemen die het aantal en het lijden van dieren die bij experimenten worden gebruikt of de vervanging van het diermodel door een ander modelsysteem¹⁰minimaliseren. Met de ontdekking van fluorescerende eiwitten en de creatie van biomarkerlijnen bieden transgene technologieën een goed alternatief¹¹. Met deze lijnen kan de activering van een oestrogeengevoelig gen in vivo worden getest.

Onder gewervelde dieren is het potentieel van vissen bij de milieurisicobeoordeling uitstekend. Ze bieden veel voordelen ten opzichte van zoogdiermodellen: als aquatische organismen zijn ze in staat om verontreinigende stoffen door hun hele lichaam te absorberen, een groot aantal nakomelingen te produceren, en sommige van hun soorten worden gekenmerkt door korte generatietijd. Hun endocriene systeem en fysiologische processen vertonen grote gelijkenissen met andere gewervelde dieren en zelfs met zoogdieren, waaronder mensen¹².

Verschillende genen voor de detectie van oestrogene effecten bij vissen zijn ook bekend. De belangrijkste zijn de oestrogeenreceptoren aromatase-b, choriogenin-H, en vitellogenine (vtg)^7,13. Onlangs zijn er ook verschillende oestrogeenproducerende biosensorlijnen gemaakt van vismodellen die in het laboratorium worden gebruikt, zoals van zebravissen (Danio rerio)^{4,5,14,15,16,17}. Het belangrijkste voordeel van zebravissen bij het maken van biosensorlijnen is het transparante lichaam van de embryo’s en larven, omdat het fluorescerende reportersignaal vervolgens gemakkelijk in vivo kan worden bestudeerd zonder het dier op te offeren^10. Naast de bescherming van dieren, het is ook een waardevol kenmerk als het mogelijk maakt voor het bestuderen van de reactie van hetzelfde individu op verschillende tijdstippen van de behandeling¹⁸.

Deze experimenten maken gebruik van een vitellogenin reporter transgene zebravis lijn¹⁵. De transgene constructie die wordt gebruikt voor de ontwikkeling van Tg(vtg1:mCherry) heeft een lange (3,4 kbp) natuurlijke vitellogenin-1 promotor. De oestrogeenreceptor (ER) is een enhancer eiwit geactiveerd door liganden dat is een vertegenwoordiger van de steroïde / nucleaire receptor superfamilie. ER bindt aan specifieke DNA-sequenties genaamd oestrogeen respons elementen (EREs) met hoge affiniteit en transactiveert genexpressie in reactie op estradiol en andere oestrogene stoffen, dus hoe meer ERE in de promotor veroorzaakt een sterkere respons¹⁹. Er zijn 17 ERE-sites in het promotorgebied van de Transgene-bouwer Tg(vtg1:mCherry) en van hen wordt verwacht dat ze de expressie van het inheemse vtg-gen¹⁵nabootsen. Er is een continue expressie van het fluorescerende signaal bij seksueel gerijpte vrouwen. Bij mannen en embryo’s is de expressie in de lever echter alleen zichtbaar bij behandeling met oestrogene stoffen (figuur 1).

Figuur 1: Rood fluorescerend signaal in de lever van vtg1:mCherry transgene volwassen zebravis en 5 dpf embryo’s, na 17-ß-estradiol (E2) inductie. Bij vrouwen en bij mannen die met E2 worden behandeld (25 μg/L blootstellingstijd:48 uur) is sterke fluorescentie van de lever zelfs zichtbaar via de gepigmenteerde huid. Er is geen fluorescerend signaal zichtbaar bij onbehandelde mannen(A). Na E2-inductie (50 μg/L-blootstellingstijd: 0-120 pk) kan ook een rood fluorescerend signaal in de lever van 5 dpf-embryo’s worden waargenomen, wat niet zichtbaar is bij controleembryo’s (B). Terwijl het fluorescerende signaal continu aanwezig is bij volwassen vrouwtjes, zijn voornamelijk mannetjes en embryo’s van de lijn geschikt voor het detecteren van oestrogene effecten. (BF: helder veld, mCherry: rode fluorescerende filterweergave, enkele effen beelden, schaalbalk A: 5mm, schaalbalk B: 250 μm) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Net als bij de endogene vitellogenine, wordt de mCherry-verslaggever alleen uitgedrukt in de lever. Omdat vitellogenine alleen wordt geproduceerd in aanwezigheid van oestrogeen, is er geen fluorescerend signaal in de controles. Omdat de uitdrukking alleen in de lever zit, is de evaluatie van de resultaten veel gemakkelijker¹⁵.

De gevoeligheid en bruikbaarheid van de embryo’s van deze lijn zijn onderzocht op verschillende oestrogene samengestelde mengsels en ook op milieumonsters^15,20, en in de meeste gevallen werden dosisresponsrelaties gedocumenteerd ( figuur2). In het geval van zeer toxische, voornamelijk hepatoxische stoffen (bijvoorbeeld zearalenon) kan echter slechts een zeer zwak fluorescerend signaal zichtbaar zijn in de lever van behandelde embryo’s en kan het veroorzaakte maximale fluorescerende signaal worden bereikt binnen een zeer klein concentratiebereik, waardoor het moeilijk is om dosis-effectrelaties vast te stellen²⁰.

Figuur 2: Dosisresponsdiagram (A) en fluorescerende beelden (mCherry) van de lever (B) blootgesteld aan 17-α-ethynilestradiol (EE2), in 5 dpf vtg1:mCherry larven. De resultaten worden uitgedrukt als geïntegreerde dichtheid gegenereerd uit de signaalsterkte en de grootte van het getroffen gebied (±SEM, n = 60). 100% verwijst naar het waargenomen maximum. Fluorescerende signaalintensiteit nam geleidelijk toe met concentratie. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Er zijn verschillende oestrogene stoffen aanwezig in het milieu, zoals 17-β-estradiol (milieuconcentratie: 0,1–5,1 ng/L)²¹, 17-α-ethynylestradiol (milieuconcentratie: 0,16–0,2 μg/L L)²², zearalenon (milieuconcentratie: 0,095–0,22 μg/L)²³, bisfenol-A (milieuconcentratie: 0,45–17,2 mg/L)²⁴. Bij het testen van deze stoffen in zuiver actieve vorm met behulp van mCherry transgene embryo’s waren de laagste waargenomen effectconcentraties (LOEC) voor fluorescerende tekendetectie 100 ng/L voor 17-ß-estradiol, 1 ng/L voor 17-α-ethynilestradiol, 100 ng/L voor zearalenon en 1 mg/L voor bisfenol-A (96-120 hpf behandeling), die zeer dicht bij of binnen het bereik van milieuconcentraties van de stoffen¹⁵ligt. De transgene lijn Tg(vtg1:mCherry) kan helpen bij het detecteren van oestrogeen in afvalwatermonsters na directe blootstelling. De lijn is zo gevoelig als de veelgebruikte gist oestrogeen test, de bioluminiscente gist oestrogeen (BLYES) test¹⁵. Met behulp van deze lijn, de beschermende effecten van bèta-cyclodextrins tegen zearalenon-geïnduceerde toxiciteit is bevestigd met behulp van chemische mengsels²⁰.

In een recent rapport werd het in vivo gebruik van de transgene lijn aangetoond met behulp van twee oestrogene zearalenon (ZEA) metabolieten, α- en β-zearalenol (α-ZOL en β-ZOL)²⁵. De baseline van het protocol is geschikt om de oestrogene effecten van verschillende verbindingen of milieumonsters op Tg(vtg1:mCherry) embryo’s te bestuderen.