Summary

Visualisation et analyse du transport intracellulaire d'organites et d'autres cargaisons dans les astrocytes

Published: August 28, 2019
doi:

Summary

Ici nous décrivons une méthode in vitro de live-imaging pour visualiser le transport intracellulaire des organelles et le trafic des protéines de membrane de plasma dans les astrocytes murines. Ce protocole présente également une méthodologie d’analyse d’image pour déterminer les itinéraires et la cinétique du transport de marchandises.

Abstract

Les astrocytes sont parmi les types de cellules les plus abondants dans le cerveau adulte, où ils jouent des rôles clés dans une multiplicité de fonctions. En tant qu’acteur central de l’homéostasie cérébrale, les astrocytes fournissent aux neurones des métabolites vitaux et tamponnent l’eau extracellulaire, les ions et le glutamate. Composante intégrale de la synapse tri-partite, les astrocytes sont également essentiels à la formation, à l’élagage, à l’entretien et à la modulation des synapses. Pour permettre ces fonctions hautement interactives, les astrocytes communiquent entre eux et avec d’autres cellules gliales, neurones, vascularisation du cerveau et environnement extracellulaire à travers une multitude de protéines membranaires spécialisées qui incluent des cellules molécules d’adhérence, d’aquaporines, de canaux ioniques, de transporteurs de neurotransmetteurs et de molécules de jonction d’écart. Pour soutenir ce flux dynamique, les astrocytes, comme les neurones, s’appuient sur un transport intracellulaire étroitement coordonné et efficace. Contrairement aux neurones, où le trafic intracellulaire a été largement délimité, le transport à base de microtubules dans les astrocytes a été moins étudié. Néanmoins, le trafic exo- et endocytic des protéines de membrane cellulaire et du transport intracellulaire d’organelle orchestre la biologie normale des astrocytes, et ces processus sont souvent affectés dans la maladie ou en réponse aux dommages. Ici, nous présentons un protocole simple à la culture de haute qualité astrocytes murine, à fluorescentétique des protéines astrocytiques et des organites d’intérêt, et d’enregistrer leur dynamique de transport intracellulaire en utilisant la microscopie confocale time-lapse. Nous démontrons également comment extraire et quantifier les paramètres de transport pertinents des films acquis à l’aide du logiciel d’analyse d’image disponible (c.-à-d. ImageJ/FIJI).

Introduction

Les astrocytes sont les cellules les plus abondantes dans le système nerveux central adulte, où ils exécutent des fonctions développementales et homéostatiques uniques1. Les astrocytes modulent le développement synaptique par le contact direct avec les terminaux pré- et postsynaptiques dans le cadre de la synapse tri-partite, qui contient des récepteurs de neurotransmetteur, des transporteurs, et des molécules d’adhérence de cellules qui facilitent la formation de synapse et la communication neuronale-astrocyte2. En outre, les astrocytes contrôlent activement la transmission synaptique et empêchent l’excitotoxicité neuronale en supprimant rapidement les neurotransmetteurs excitatifs de la fente synaptique, en recyclant les neurotransmetteurs et en participant à l’élagage synaptique3 , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6.Pour activer ces fonctions hautement interactives, les astrocytes communiquent entre eux, avec d’autres cellules gliales, et avec les neurones par le biais de protéines membranaires spécialisées, y compris les molécules d’adhérence cellulaire, les aquaporines, les canaux ioniques, les transporteurs de neurotransmetteurs et les molécules de jonction d’écart. Les astrocytes modifient activement les niveaux de surface de ces protéines en réponse aux fluctuations de leur environnement intra- et extracellulaire7. En outre, les changements dans les niveaux et la distribution des mitochondries, des gouttelettes lipidiques et des organites dégradatifs et de recyclage modulent l’approvisionnement énergétique, la disponibilité des métabolites et les processus de compensation cellulaire qui sont essentiels à la fonction des astrocytes et survie.

Les changements dynamiques dans le trafic de protéines membranaires et d’organelle et le positionnement dans les astrocytes sont facilités par la fonction concertée des protéines motrices et des adaptateurs qui favorisent la motilité de la cargaison8,9. De même, les niveaux de surface des protéines membranaires sont modulés par l’internalisation et le recyclage des événements10. Ces cargaisons sont transportées par un réseau complexe d’actine, de microtubules et peut-être de filaments intermédiaires8. Les études basées sur la coloration d’immunofluorescence de la protéine de liaison final 1 (EB1), qui s’accumule au microtubule croissant plus extrémités, suggèrent que dans les faisceaux d’astrocytes des microtubules rayonnent hors du périnucleus et d’étendre leur extrémité plus vers le périphérie11. Cependant, un examen complet de l’organisation et de la polarité des microtubules et d’autres éléments cytosquelettiques utilisant la formation image de cellules vivantes manque toujours. Tandis que beaucoup des mécanismes sous-jacents à la dynamique des organelles et des protéines membranaires ont été intensivement étudiés dans les neurones et d’autres types de cellules, la motilité de cargaison dans les astrocytes est moins bien comprise. La plupart de nos connaissances actuelles sur les changements dans la distribution des protéines et des organites dans les astrocytes est basée sur l’étiquetage traditionnel à base d’anticorps de la préparation fixe, ce qui empêche l’examen spatial et temporel précis de la dynamique du fret7, 12.

Ici, nous décrivons une méthode pour étiqueter des protéines de membrane et des organites pour l’imagerie vivante dans les cultures primaires d’astrocyte de souris de haute pureté. À l’aide de ce protocole, nous fournissons des exemples dans lesquels nous suivons la localisation dynamique des protéines de membrane fluorescentes vertes (GFP) dans les astrocytes transfectés, y compris la connexine de protéine de jonction d’écart 43 (Cx43-GFP) et l’acide aminé excitateur transporteur 1 (EAAT1-GFP). Nous décrivons également l’utilisation d’une sonde acidotrope fluorescente pour visualiser les organites acides et suivre leur dynamique de trafic dans les astrocytes vivants. Enfin, nous démontrons comment analyser les données time-lapse pour extraire et évaluer les paramètres de transport des cargaisons individuelles.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l’approbation de l’Université de Caroline du Nord au Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Dissection de cerveau et culture des astrocytes primaires de souris REMARQUE: Le protocole suivant a été adapté à partir de méthodes publiées, qui suit la procédure originale développée par McCarthy et deVellis13,14,<sup class…

Representative Results

Le protocole pour établir les astrocytes mD primaires de souris décrits ci-dessus devrait produire des cultures reproductibles et de haute qualité. Bien que les cultures contiennent initialement un mélange d’astrocytes, de fibroblastes et d’autres cellules gliales, y compris les microglies et les oligodendrocytes (figure1Bi,Biv; pointes de flèches rouges), l’ajout d’AraC à la culture mixte entre DIV5-DIV7 minimise la prolifération de ces cellules contaminantes. Le tra…

Discussion

Ici, nous décrivons une approche expérimentale pour exprimer, visualiser, et suivre les organites fluorescents marqués et les protéines de membrane d’intérêt utilisant la microscopie vidéo time-lapse dans les astrocytes corticales corticaux primaires de souris de haute pureté de MD. Nous énoncions également une méthodologie de mesure de la dynamique des particules. La visualisation directe de la dynamique des protéines et des organites dans les astrocytes primaires fournit un outil puissant pour étudier la r…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DNL a été soutenu par l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC) School of Medicine en tant que boursier Simmons. TWR a reçu le soutien de la subvention PREP R25 GM089569 de l’UNC. Les travaux utilisant le Centre de microscopie de l’UNC Microscopy Core Facility ont été soutenus, en partie, par le financement de la subvention de soutien du NIH-NINDS Neuroscience Center P30 NS045892 et du NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Center Support Grant U54 HD079124.

Materials

2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090-046
Benchtop Centrifuge Thermo Scientific 75-203-637 Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water Gen Clone 25-511
Cell Culture Microscope Zeiss WSN-AXIOVERT A1 Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside Sigma C1768-100MG (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI Sigma D9542-5MG Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 305
Dissecting Scissors F.S.T 14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gen Clone 25-500
Fetal Bovine Serum Gemini 100-106 Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH Version 1.52i
Fine Tip Tweezers F.S.T 11254-20 Style #5
Fluorescence light source Excelitas 012-63000 X-Cite 120Q
GFAP antibody Cell Signaling 3670S GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes Mattek corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps F.S.T 11054-10 Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) Life Technologies L7526 LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x) Gibco 14065-056 Magnesium and calcium free
Imaging Media Life Technologies A14291DJ Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope Zeiss LSM 780
KymoToolBox https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent Life Technologies 11514015 Plus Reagent
Lipofection Reagent Life Technologies 15338100 Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator New Brunswick Scientific 8261-30-1008 Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x) Gen Clone 25-512
Phosphate Buffered Saline (10x) Gen Clone 25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7405 Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium Gibco 31985-062 OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks Olympus Plastics 25-209 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator Thermo Scientific 51030285 HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base Sigma T1503 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl Sigma T3253 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Vacuum-Driven Filter Systems Olympus Plastics 25-227 500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight Roboz RS-5620

Referenzen

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
  3. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
  4. Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
  5. Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
  6. Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
  7. Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
  8. Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
  9. Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
  10. Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
  11. Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
  12. Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
  13. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
  14. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  15. Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
  16. Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
  17. . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)

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Diesen Artikel zitieren
Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).

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