アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

アストロサイトは、成人中枢神経系で最も豊富な細胞であり、そこではユニークな発達および恒容性機能1を実行する。アストロサイトは、シナプス形成を促進する神経伝達物質受容体、トランスポーター、および細胞接着分子を含む三分詞シナプスの一部として、前および後の末端との直接接触を通じてシナプスの発達を調節するとニューロン-星状細胞通信².さらに、アストロサイトはシナプス伝達を積極的に制御し、シナプス裂から興奮性神経伝達物質を迅速に除去し、神経伝達物質をリサイクルし、シナプス剪定^に参加することにより、神経興奮毒性を防ぎます3^,4,5,6.これらの非常にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、他のグリア細胞と、細胞接着分子、アクアポリン、イオンチャネルを含む特殊な膜タンパク質を介してニューロンと、自分自身の間で通信します。神経伝達物質トランスポーター、およびギャップ接接点分子。アストロサイトは、細胞内および細胞外環境の変動に応じて、これらのタンパク質の表面レベルを積極的に変化^させる7.さらに、ミトコンドリア、脂質液滴、分解およびリサイクルオルガネラのレベルと分布の変化は、エネルギー供給、代謝物の利用可能性、および星状細胞機能に不可欠な細胞クリアリングプロセスを調節し、生存。

アストロサイトにおける膜タンパク質およびオルガネラの人身売買および位置の動的変化は、貨物運動性^を促進する運動タンパク質およびアダプターの協調機能によって促進される8、9。同様に、膜タンパク質の表面レベルは、内部化およびリサイクル^{イベント10}を通じて変調される。これらの貨物は、アクチン、微小管、およびおそらく中間フィラメントトラック8の複雑なネットワークを介して輸送されます。成長する微小管プラス末端に蓄積する末結合タンパク質1(EB1)の免疫蛍光染色に基づく研究は、微小管の鎖束が末端から放射し、そのプラス端を向いて拡張することを示唆している。周辺¹¹.しかし、生細胞イメージングを用いて微小管やその他の細胞骨格素子の組織と極性を総合的に調べると、まだ不足している。オルガネラや膜タンパク質のダイナミクスの基礎となるメカニズムの多くは、ニューロンやその他の細胞型で広く研究されているが、アストロサイトの貨物運動性はあまりよく理解されていない。アストロサイトにおけるタンパク質およびオルガネラ分布の変化に関する我々の現在の知識のほとんどは、貨物ダイナミクス7の正確な空間的および時間的検査を妨げる固定製剤の従来の抗体ベースの標識に基づいている。 ¹².

ここでは、高純度の一次マウス星状細胞培養におけるライブイメージング用膜タンパク質および小器官に標識する方法について説明する。このプロトコルを使用して、ギャップ接合タンパク質コネキシン43(Cx43-GFP)および興奮性アミノ酸を含むトランスフェクト星状細胞における緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き膜タンパク質の動的局在を追跡する例を提供します。トランスポーター1(EAAT1-GFP)。また、蛍光酸性プローブを用いて酸性小器官を可視化し、生きた星状細胞におけるその人身売買のダイナミクスに従うことも説明する。最後に、タイムラプスデータを分析して、個々の貨物の輸送パラメータを抽出して評価する方法を示します。