Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik
Summary
Burada, connexin 43 arasındaki boşluk kavşağını bozacak ve bunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini çekişler ve hücreler arası gerilimlerin gözlemi yoluyla ölçmek için mekanik tabanlı bir protokol salıyoruz.
Abstract
Endotel hücreleri hücreler arası gerilmeler ve çekişler oluşturmak için kurulmuştur, ancak endotel selüloz ve çekiş üretiminde rol boşluğu kavşakları oynamak şu anda bilinmemektedir. Bu nedenle, burada gap junction connexin 43 (Cx43) endotel biyomekanik üzerinde bilinen bir Cx43 inhibitörü 2,5-dihidroksichalcone (chalcone) ve confluent endotel monolayers maruz kalarak etkisini araştırmak için mekanik tabanlı bir protokol sasürdeyiz bu inhibitörün çekişler ve hücreler arası gerilmeler üzerindeki etkisini ölçmek. Kontrole kıyasla yüksek bir chalcone dozu (2 μg/mL) altında hem çekişlerde hem de hücreler arası streslerde azalma gösteren temsili sonuçlar salıyoruz. Bu protokol sadece Cx43’e değil, uygun inhibitörün kullanıldığı varsayarak diğer boşluk kavşaklarına da uygulanabilir. Bu protokolün kardiyovasküler ve mekanobiyoloji araştırma alanlarında yararlı olacağına inanıyoruz.
Introduction
Fiziksel kuvvetlerin ve mekanik özelliklerin hücresel ve doku fizyolojisi ve patolojisi üzerindeki etkilerinin incelenmesine atıfta bulunan alan mekobiyoloji1olarak bilinir. Mekanobiyolojide kullanılan birkaç yararlı teknik monolayer stres mikroskobu ve traksiyon kuvveti mikroskobutur. Çekiş kuvveti mikroskopisi hücre-substrat arabiriminde üretilen çekişlerin hesaplanmasına olanak sağlarken, monokatmanlı stres mikroskobu, tek katmanlı hücreler arasında oluşan hücreler arası gerilimlerin tek katmanlı olarak hesaplanmasına olanak sağlar2 ,3,4,5,6. Önceki yöntemlerden elde edilen sonuçlar hücre kaynaklı mekanik gerilmeler hücresel süreçlerin bir dizi kaderi belirlemede önemli bir rol oynadığını ileri sürmüşlerdir3,4,5. Örneğin, harici bir mekanik kuvvete maruz kaldıktan sonra, kolektif olarak göç eden bir grup hücre morfolojilerini değiştirebilir ve şekillerini polarize ederek, kısmen çekiş ler üreterek, uygulanan kuvvet inisi boyunca hizalayabilir ve göç edebilir. 8 . Çekişler hücre kontraksiyonu değerlendirmek için kullanılabilecek ve çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) kullanılarak hesaplanan bir metrik sağlar. Traksiyon kuvveti mikroskobu (TFM), matematiksel olarak titiz, mekanik tabanlı hesaplamalı bir yaklaşımla çekiş alanının hesaplanmasının ardından hücre kaynaklı substrat deformasyonlarının belirlenmesiyle başlar. Çekiş hesaplama yeteneği oldukça uzun bir süre için yaklaşık olduğundan, araştırmacılar tfm etkileri çekişler bir dizi süreçler üzerinde ortaya çıkarmak için kullandık9, yara iyileşmesi10 ve mühendislik kardiyak değerlendirilmesi doku11.
TFM ve MSM’nin birlikte uygulanması aşağıdaki sırayla yürütülmesi gereken üç temel adıma ayrılabilir: birincisi, hücreler tarafından üretilen hidrojel deformasyonları belirlenir; ikincisi, çekişler hidrojel deformasyonlarından kurtarılır; ve üçüncüsü, sonlu elemanlar yaklaşımı tüm monolayer içinde normal ve makas hücreler arası gerilmeleri hesaplamak için kullanılır. Jel yer değiştirmelerini hesaplamak için, hücrelerle floresan boncuk görüntüleri, özel olarak yazılmış parçacık görüntüsü velocimetry (PIV) rutini kullanılarak referans boncuk görüntüsü (hücresiz) ile karşılaştırıldı. PIV analizi için çapraz korelasyon pencere boyutu ve çakışması sırasıyla 32 x 32 piksel ve 0,5 olarak seçilmiştir. Şu anda, piksel kaymaları bir piksel-mikron dönüştürme faktörü ile çarpılarak mikronlara dönüştürüldü (mikroskobumuz için, bu dönüşüm faktörü 0,65’tir) düzlem içi yer değiştirmeleri elde etmek için. Düzlem dışı yer değiştirmeleri yoksayma ile ilişkili hatalar ihmal edilebilir12,13. Jel deplasmanları hesaplandıktan sonra, kullanılabilir çekiş ölçümleri iki türü vardır, kısıtlı çekiş ler ve sınırlandırılmamış çekişler8,14. Sınırlandırılmamış çekişler tüm görüş alanı için çekiş alanı sağlarken (hücreleri olan ve olmayan bölgeler dahil), kısıtlı çekişler ise yalnızca hücreleri içeren bölgeler için çekiş alanını sağlar14. Daha sonra, hücreler arası gerilmeler çekiş kuvveti mikroskobu bir uzantısı olan monolayer stres mikroskobu (MSM) kullanılarak hesaplanır. MSM’nin uygulanması, hücre-substrat arabiriminde tek hücre katmanı tarafından uygulanan yerel çekişlerin Newton yasalarının gerektirdiği hücre-hücre arabirimindeki hücreler arasında iletilen mekanik kuvvetler tarafından dengelenmesi gerektiği varsayımına dayanır7 ,12,13. Burada önemli bir varsayım hücre monolayer ince bir elastik levha olarak tedavi edilebilir, çünkü monolayer çekiş dağılımı bilinen ve kuvvet dengesi hücre malzeme özelliklerine bağlı değildir. Başka bir önemli varsayım çekiş kuvvetleri görüş optik alan içinde yerel hücreler arası stresler tarafından dengeli olduğunu (monolayer içinde) ve bu kuvvet dengesinin etkisi distal bölgede en az (monolayer dışında)13. Bu nedenle, hücreler arası gerilmeler, yer değiştirmeler veya her ikisinin tek katmanlı sınırdaki bir kombinasyonu tarafından tanımlanan sınır koşulları MSM13’ügerçekleştirmek için çok önemlidir. Yukarıdaki bilgileri dikkate alarak, msm’yi sonlu elemanlar analizi (FEM) yaparak maksimum ana gerilimi (σmax)ve minimum ana gerilimi (σmin)içinde her noktada döndürerek geri alabiliriz. tek katmanlı. Bu temel gerilmeler daha sonra 2B ortalama normal hücreler arası gerilimi [(σmax + σmin) ve 2D maksimum kesme hücre içi gerilimi [(σmax – σmin) /2] tüm monolayer içinde hesaplamak için kullanılır 12,13. Bu prosedür Tambe ve ark.12,13 tarafından daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır
Monolayer stres mikroskobu (MSM) bir monolayeriçindeoluşturulan hücre-hücre içi gerilmelerin hesaplanması için izin verir 6,7,8,12,13. Bu hücreler arası stresler doku büyüme ve onarım, yara iyileşmesi ve kanser metastazı için önemli olduğu ileri sürülmüşlerdir12,15,16,17. Buna ek olarak, intersellüler stresler de endotel hücre göçü ve endotel bariyer fonksiyonu önemli olduğu ileri sürülmüştür17,18. Sıkı kavşaklar ve yapışık kavşaklar gibi hücre-hücre kavşaklarının hem endotel hücreiçi stres oluşumunda ve iletiminde kritik bir rol oynadığı öne sürülürken, boşluk bağlantılarının rolü hala belirsizdir. Gap kavşakları fiziksel olarak komşu hücreleri bağlamak ve elektrik akımı ve moleküller (<1 KDa) komşu hücreler arasında geçmek için bir yol sağlamak19,20,21. Endotel hücreleri Cx37 ifade rağmen, Cx40, ve Cx43 boşluk kavşaklar19,22, Cx43 muhtemelen hastalığın ilerlemesi açısından en önemli23. Cx43’ün önemine dair kanıtlar, farelerde Cx43’ün genetik olarak silinmesi hipotansiyon24 ile sonuçlanır ve anjiyogenez üzerinde yan etkileri vardır25. Buna ek olarak, Cx43 hücre göçü ve çoğalması için önemli olduğu belgelenmiştir ve aterosklerozilerlemesi 18,22,23,24,25 .
Bu protokolde, endotelsel boşluk kavşak Cx43 bozulmasından etkilenecek confluent, endotel yaltekerlik içinde çekiş ve hücreler arası stres oluşumunu araştırmak için TFM ve MSM’yi kullandık. Biz 2,5-dihidroksikalson (chalcone), cx43 ifade26inhibe belgelenmiş bir molekül ile Cx43 bozdu. Chalcone cx43 ifade26bozmak için Lee ve ark. tarafından daha önce bildirilmiştir olarak siRNA yerine Cx43 bozmak için kullanılmıştır . Buna ek olarak, biz özellikle endotel üzerinde chalcone etkisi de potansiyel olarak çeşitli vasküler önlenmesi ve tedavisi için kullanılabilecek bir anti-inflamatuar ve anti-trombosit bileşik olduğu bildirilmiştir ilgilendi patolojiler26. Chalcone tedavileri deney başlangıcından bir saat sonra yapıldı, chalcone ile tedavi edilen monolayers toplam altı saat boyunca görüntülendi ve görüntü işleme çekiş belirlemek için özel olarak yazılmış mATLAB kodu ile yapıldı ve daha sonra hücreler arası strese neden olabilir. Sonuçlarımız çekişlerde ve hücreler arası streslerde genel bir düşüş olduğunu göstererek, Cx43’ün endotel biyomekaniğinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grubumuz, yanı sıra diğerleri, başarıyla çeşitli patolojik ve fizyolojik hücresel süreçlerde hücre-hücre kavşaklarının etkisini araştırmak için TFM ve MSM kullanarak olmuştur in vitro7,15,18,27 . Örneğin, Hardin ve ark. endotel hücrelerinde hücreiçi stres iletimkılavuzları15. Burada bildirdiğimiz Cx43 ile ilgili değişiklikleri Hardin ve ark.’…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Merkezi Florida Üniversitesi start-up fonları ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüsü ödül K25HL132098 altında desteklenmiştir.
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
Referenzen
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Entwicklungsbiologie. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2′,5′-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
