通过 Connexin 43 结构中断干扰内皮生物力学
Summary
在这里，我们提出了一个基于力学的协议，以破坏间隙结康康辛43，并通过观察牵引力和细胞间应力测量其对内皮生物力学的后续影响。
Abstract
内皮细胞已经建立，以产生细胞间应力和牵引，但间隙结在内皮细胞间应力和牵引生成中的作用目前尚不清楚。因此，我们在这里提出了一个基于力学的协议，通过向已知的Cx43抑制剂2，5-二羟基沙酮（chalcone）和测量该抑制剂对牵引力和细胞间应力的影响。我们提出了具有代表性的结果，与对照相比，在高沙酮剂量（2微克/mL）下，牵引力和细胞间应力均有所下降。该协议不仅适用于 Cx43，还适用于其他间隙结，前提是使用适当的抑制剂。我们相信，该协议将在心血管和美能生物学研究领域有用。
Introduction
研究物理力和机械特性对细胞和组织生理学和病理学的影响的领域被称为机械生物学1。在微量生物学中已经应用的一些有用的技术是单层应力显微镜和牵引力显微镜。牵引力显微镜允许计算在细胞基板界面生成的牵引力，而单层应力显微镜允许计算单层2内相邻细胞之间产生的细胞间应力 ，3，4，5，6.从以前的方法得出的结果表明，细胞源的机械应力在决定一系列细胞过程3、4、5的命运中起着至关重要的作用。例如，在暴露于外部机械力时，作为集体迁移的一组细胞可以改变其形态，使其形状极化，从而沿施加力的方向对齐和迁移，部分产生牵引力7， 8.牵引力提供可用于评估细胞收缩性且使用牵引力显微镜 （TFM） 计算的指标。牵引力显微镜 （TFM） 首先确定细胞引起的基板变形，然后使用数学严谨的基于力学的计算方法计算牵引场。由于计算牵引力的能力已经存在了相当长的时间，研究人员利用TFM揭示了牵引力对一系列过程的影响，包括癌症9、伤口愈合10和工程心脏评估组织11.
TFM和MSM的实现可以分为三个基本步骤，必须按以下顺序执行：第一，确定细胞产生的水凝胶变形;第二，从水凝胶变形中恢复牵引力;第三，使用有限元法计算整个单层内的法线和剪切细胞间应力。为了计算凝胶位移，使用自定义编写的粒子图像速度测量（PIV）例程，将具有细胞的荧光珠图像与参考珠图像（无细胞）进行比较。PIV 分析的交叉关联窗口大小和重叠分别选择为 32 x 32 像素和 0.5 像素。此时，像素偏移被转换为微米，通过乘以像素到微米的转换系数（对于我们的显微镜，此转换系数为 0.65）来获得平面内位移。与忽略平面外位移相关的错误可以忽略12，13。在计算凝胶位移后，可以使用两种类型的牵引力测量，约束牵引力和无约束牵引力8、14。无约束牵引力为整个视场（包括带单元和无单元的区域）提供牵引场，而约束牵引力仅为包含单元14的区域提供牵引场。然后，使用单层应力显微镜（MSM）计算细胞间应力，这是牵引力显微镜的延伸。MSM的实现基于以下假设：细胞基质界面上单层细胞施加的局部牵引力必须按照牛顿定律7 的要求，通过细胞-细胞界面上的细胞之间传输的机械力来平衡。 ，12，13.此处的一个关键假设是，细胞单层可以被视为薄弹性片，因为单层中的牵引力分布是已知的，并且力平衡不依赖于细胞材料属性。另一个关键假设是牵引力由光学视场（单层内）内的局部细胞间应力平衡，这种力平衡在远端区域（单层外）13中的影响最小。因此，由细胞间应力、位移或单层边界处两者的组合定义的边界条件对于执行 MSM13至关重要。考虑到上述信息，我们利用 MSM 执行有限元分析 （FEM）， 通过在膜。这些主应力随后用于计算整个单层内的 2D 平均正常细胞间应力[（[ 最大值] ±最小） /2] 和 2D 最大剪切细胞间应力 [（[最大值– ±最小] /2]12，13.Tambe等人12、13更详细地描述了这一过程。
单层应力显微镜（MSM）允许计算在单层6、7、8、12、13内产生的细胞细胞间应力。这些细胞间应力被建议是重要的组织生长和修复，伤口愈合，和癌症转移12，15，16，17。此外，细胞间应力也被认为在内皮细胞迁移和内皮屏障功能17，18也很重要。虽然细胞-细胞结，如紧密结和附着结都建议在内皮细胞间应力生成和传输中发挥关键作用，但间隙结的作用仍然难以捉摸。间隙结物理地连接相邻的细胞，为电流和分子（<1 KDa）在相邻细胞19、20、21之间传递提供一条通道。虽然内皮细胞表达Cx37，Cx40和Cx43间隙结19，22，Cx43可以说是最重要的疾病进展23。Cx43的重要性的证据可以发现的事实，在小鼠的Cx43基因删除导致低血压24，并有不良影响的血管生成25。此外，Cx43 已被记录为重要的细胞迁移和增殖和动脉粥样硬化的进展18，22，23，24，25.
在此协议中，我们使用 TFM 和 MSM 来调查在交波内皮单层内产生的牵引力和细胞间应力是否会受到内皮间隙结 Cx43 中断的影响。我们用2，5-二羟基沙酮（chalcone）扰乱了Cx43，一种被记录抑制Cx43表达26的分子。查尔酮被用来破坏Cx43，而不是siRNA，因为查尔酮以前曾被李等人报道，以扰乱Cx43表达26。此外，我们对沙酮对内皮的影响特别感兴趣，因为它也被报道为抗炎和抗血小板化合物，可能可用于预防和治疗各种血管病理学26。在实验开始一小时后进行切尔酮处理，对经过切尔酮处理的单层共成像6小时，并使用定制编写的MATLAB代码进行图像处理，以确定牵引力和随后的细胞间应力。我们的结果显示，牵引力和细胞间应力总体下降，这表明 Cx43 在内皮生物力学中起着关键作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们小组，以及其他小组，已经成功地使用TFM和MSM来探索细胞-细胞结在体外7、15、18、27的各种病理和生理细胞过程中的影响.例如，哈丁等人提出了一个非常有见地的研究，表明细胞间应力传输指导了内皮细胞15的准细胞间隙形成。虽然我们在这里报告的 Cx43 相关更改与 Hardin 等人报…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中佛罗里达大学启动基金和国家卫生研究院国家心肺血液研究所的K25HL132098资助。
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
Referenzen
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