Summary

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Published: September 18, 2019
doi:

Summary

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Abstract

Studies op het gebied van angiogenese zijn in de laatste decennia agressief gegroeid met de erkenning dat angiogenese een kenmerk is van meer dan 50 verschillende pathologische aandoeningen, zoals reumatoïde artritis, oculopathie, cardiovasculaire aandoeningen , en tumor metastasen. Tijdens de ontwikkeling van angiogenese is het van cruciaal belang om in vitro assay systemen met geschikte celtypen en goede condities te gebruiken om het fysiologisch angiogenese proces weer te geven. Om de beperkingen van de huidige in vitro angiogenese assay systemen met behulp van voornamelijk endotheel cellen te overwinnen, ontwikkelden we een 3-dimensionaal (3D) Co-Culture spheroid kiemen assay systeem. Co-Culture sferoïden werden geproduceerd door twee humane vasculaire celprecursoren, endotheliale kolonie vormende cellen (ecfcs) en mesenchymale stamcellen (MSCS) met een ratio van 5 tot 1. Ecfcs + MSCS sferoïden werden ingebed in de type I collageenmatrix om de in vivo extracellulaire omgeving na te bootsen. Er werd een real-time celrecorder gebruikt om de progressie van angiogene kiemen van sferoïden gedurende 24 uur continu te observeren. er werd ook een live-cel fluorescerende etiketterings techniek toegepast om de lokalisatie van elk celtype tijdens kiemvorming te tracten. Het angiogene potentieel werd gekwantificeerd door het aantal kiemgroenten te tellen en de cumulatieve lengte van kiemgroenten die uit de individuele spheroïden voortvloeien te meten. Vijf willekeurig geselecteerde sferoïden werden per experimentele groep geanalyseerd. Vergelijkings experimenten toonden aan dat ecfcs + MSCS sferoïden een groter kiemgetal en een cumulatieve kiem lengte vertoonden in vergelijking met ecfcs-alleen sferioïden. Bevacizumab, een door de FDA goedgekeurde Angiogeneseremmer, werd getest met het nieuw ontwikkelde co-Culture spheroid assay-systeem om te controleren of het mogelijk is Anti-angiogene geneesmiddelen op te schermen. De IC50 -waarde voor ecfcs + MSCS-sferoïden in vergelijking met de ecfcs-alleen-sferoïden was dichter bij de effectieve plasmaconcentratie van Bevacizumab verkregen uit het xenotransplantaatmodellen is tumor muismodel. De huidige studie suggereert dat het 3D ECFCs + MSCs spheroid angiogenese systeem relevant is voor de fysiologische angiogenese en een effectieve plasmaconcentratie kan voorspellen vóór dier experimenten.

Introduction

Ongeveer 500.000.000 mensenwereld wijd wordt verwacht te profiteren van angiogenese-modulerende therapie voor vasculaire malformatie-geassocieerde ziekten zoals reumatoïde artritis, oculopathie, cardiovasculaire aandoeningen, en tumor metastasen1. De ontwikkeling van geneesmiddelen die angiogenese beheersen is dus uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied in de farmaceutische industrie. Tijdens het proces van de ontwikkeling van de drug, in vivo dierlijke studie is nodig om te verkennen van de effecten van drugs kandidaten op fysiologische functies en systemische interacties tussen organen. Echter, ethische en kosten kwesties hebben de bezorgdheid over dierproeven verhoogd2. Daarom zijn verbeterde in vitro assay-systemen nodig om nauwkeurigere en voorspelbare gegevens te verkrijgen die leiden tot betere besluitvorming voor dierproeven. Huidige in vitro angiogenese assays meten meestal proliferatie, invasie, migratie of tubulaire structuur vorming van endotheliale cellen (ECs) in tweedimensionale (2D) cultuur platen3. Deze 2D angiogenese testen zijn snel, eenvoudig, kwantitatief en kosteneffectief, en hebben aanzienlijk bijgedragen aan de ontdekking van angiogenese-modulerende geneesmiddelen. Er moeten echter nog enkele kwesties worden verbeterd.

Dergelijke 2D in vitro assay-systemen kunnen geen complexe multi-step-gebeurtenissen van angiogenese weerspiegelen die in vivo fysiologische omstandigheden voorkomen, wat leidt tot onnauwkeurige resultaten die discrepanties veroorzaken tussen in vitro assay gegevens en resultaten van klinische proeven4. 2D cultuuromstandigheden induceren ook de verandering van cellulaire fenotypes. Bijvoorbeeld, na proliferatie in 2D cultuur platen, ECs hebben een zwakke cellulaire fenotype als gemanifesteerd door verminderde expressie van CD34 en verschillende signalen die mobiele reacties regelen5,6. Om de beperkingen van 2D-cultuurgebaseerde angiogenese systemen te overwinnen, zijn driedimensionale (3D) spheroid-testsystemen voor angiogenese ontwikkeld. Sprouting gevolgd door tubulaire structuur vorming van sferoïden gevormd door ECs reflecteren in vivo Neo-vascularisatie processen7,8. Zo is de 3D-spheroid-angiogenese test beschouwd als een effectief assay-systeem voor het screenen van potentiële Pro-of anti-angiogenese medicijnen.

De meeste 3D-spheroid-angiogenese-assays gebruiken alleen ECs, voornamelijk humane navelstreng-endotheelcellen (HUVECs) of humane dermale microvasculaire endotheliale cellen (HDMECs) om zich te concentreren op de cellulaire respons van ECs tijdens angiogenese. Echter, bloed capillairen zijn samengesteld uit twee celtypen: ECs en pericytes. Het uitwerken van bi-directionele interactie tussen ECs en pericytes is essentieel voor een goede vasculaire integriteit en functie. Verschillende ziekten, zoals erfelijke beroerte, diabetische retinopathie en veneuze malformatie, worden geassocieerd met veranderde pericyt dichtheid of verminderde pericyte gehechtheid aan het endotheel9. Pericytes zijn ook bekend als een belangrijk element van het angiogene proces. Pericytes worden gerekruteerd om nieuw gevormde scheeps structuren te stabiliseren door ECs. In dit opzicht bevat mono-Culture spheroid angiogenese test geen pericytes7,10. Daarom kan co-Culture sferoïden gevormd door ECs en pericytes een waardevolle benadering bieden voor het meer nabootsen van fysiologisch angiogene gebeurtenissen.

De huidige studie was gericht op het ontwikkelen van een 3D co-Culture spheroid-angiogenese test met een combinatie van humane endotheliale kolonie vormende cellen (ECFCs) en mesenchymale stamcellen (MSCs) om in vivo angiogenese nauwer te reflecteren. Co-Culture spheroid-systeem als een in vitro vertegenwoordiging van een normaal bloedvat werd voor het eerst vastgesteld door Korff et al. in 200111. Ze combineerden HUVECs en menselijke navel slagader gladde spiercellen (HUSMCs), en toonden aan dat de co-cultuur van twee volwassen vasculaire cellen het kiem potentieel verminderde. Volwassen ECs (huvecs) staan bekend om geleidelijk verliezen hun vermogen om te vermenigvuldigen en te differentiëren, die negatieve invloed hebben op hun angiogenese reacties12,13. Volwassen perivasculaire cellen (HUSMCs) kunnen leiden tot endotheliale celinactivatie door middel van de intrekking van de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) responsiviteit11. Het belangrijkste verschil tussen Korff en ons co-Culture spheroid-systeem zijn de gebruikte celtypes. We hebben twee vasculaire precursoren, ECFCs en MSCs, toegepast om een juiste angiogenese testsysteem op te zetten om Pro-of-Anti-angiogene agentia te onderzoeken. ECFCs zijn de voorloper van ECs. ECFCs hebben een robuuste proliferatie capaciteit in vergelijking met volwassen ECs14, die het mogelijk maken om de beperking van ECs te overwinnen. Ecfcs dragen bij aan de vorming van nieuwe schepen in vele postnatale pathologische omstandigheden15,16,17. MSCS zijn pluripotente stamcellen die het vermogen hebben om te differentiëren in pericytes, wat bijdraagt aan angiogenese18,19.

In eerdere rapporten vertoonden ecfcs en MSCS synergetische effecten op in vitro buis vorming20, in vivo Neo-vascularisatie21,22, en verbeterde reperfusie van ischemische weefsels23,24. In de huidige studie werden ecfcs en MSCS gebruikt om co-Culture sferoïden te vormen en ingebed in type I collageen gel om een in vivo 3D-omgeving weer te geven. Collageen wordt beschouwd als een belangrijke bestanddelen van de extracellulaire matrix (ECM) rond ECs25. De ECM speelt een cruciale rol bij het reguleren van Celgedrag26. Het hier voorgestelde assay-protocol kan binnen twee dagen eenvoudig en snel worden uitgevoerd met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumtechnieken. Voor effectieve celtracering tijdens het kiemen-proces kan elk celtype worden fluorescently gelabeld en bewaakt met behulp van een real-time celrecorder. Het nieuw opgerichte 3D co-Culture spheroid angiogenese systeem is ontworpen om de gevoeligheid voor het evalueren van potentiële angiogene modulatoren te verhogen en om voorspelbare informatie te verschaffen vóór in vivo onderzoek.

Protocol

Menselijke ECFCs werden geïsoleerd van menselijk perifeer bloed zoals beschreven in een eerder verslag27. Kort, de mononucleaire cellaag werd gescheiden van het hele bloed met behulp van de Ficoll-PAQUE Plus, en gekweekt in het juiste medium totdat de endotheelachtige kolonies werden verschenen. Kolonies werden verzameld en ECFCs werden geïsoleerd met behulp van CD31 gecoate magnetische kralen. MSCs waren geïsoleerd van de aanhanger van de mononucleaire cel (MNC) van het humane volwassen beenme…

Representative Results

Vergelijkings experimenten werden uitgevoerd met mono-Culture sferoïden (alleen ecfcs) en co-Culture sferoïden (ecfcs + MSCS) om te onderzoeken of MSCS een belangrijke rol spelen bij ecfcs-gemedieerde angiogenese. De kiemvorming van elke spheroid werd gedurende 24 uur bewaakt door een real-time celrecorder die de progressie van angiogene kiemen uit spheroïden kon opvangen. Het angiogene potentieel werd gekwantificeerd door het aantal kiemgroenten te tellen en de cumulatieve lengte van kiemgroenten die uit individuele …

Discussion

De huidige studie introduceert een verbeterd in vitro angiogenese assay systeem met behulp van co-cultuur sferoïden gevormd door twee menselijke vasculaire cel voor ouders, ecfcs en MSCS. co-Culture spheroid-systeem kan in vivo vasculaire kiemvorming nabootsen, wat bereikt door interactie en integratie tussen endotheliale cellen en pericytes. Vergeleken met andere in vitro angiogenese tests die alleen ECs-gemedieerde angiogenese reflecteren, is dit co-Culture assay-systeem meer representatief voor de meerstaps cascade v…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie (17172MFDS215) van het ministerie van voedsel-en geneesmiddelen veiligheid, de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Korea Government (MSIP) (2017R1A2B4005463), en het basis wetenschaps onderzoeksprogramma via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2016R1A6A1A03007648).

Materials

0.05 % Trypsin EDTA (1X) Gibco 25300-054
Bevacizumab Roche NA Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium Gibco 11885-084 DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) Gibco 21600-010 PBS (10X)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) Corning 21-031-CVR PBS (1X)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit Promocell C-22121 ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS) Atlas FP-0500A FBS
Gelatin BD Sciences 214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin Gibco 10378-016 GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2 Promocell C-28009 MSCGM-2
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI26 PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI67 PKH67
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Type I collagen gel Corning 354236
Vascular endothelial growth factor A R&D 293-VE-010 VEGF

Referenzen

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
  3. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  4. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  5. Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
  6. Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
  7. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
  8. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
  9. Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
  10. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
  11. Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
  12. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  13. Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
  14. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  15. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  16. Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
  17. Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
  18. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
  21. Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
  22. Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
  23. Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
  24. Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
  25. Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
  26. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
  27. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
  28. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  29. Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
  30. Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Shah, S., Lee, H., Park, Y. H., Jeon, E., Chung, H. K., Lee, E. S., Shim, J. H., Kang, K. Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60032, doi:10.3791/60032 (2019).

View Video