Système d'analyse d'angiogenèse tridimensionnel utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par des cellules de formation de colonies endothéliales et des cellules souches mésenchymales
Summary
Le système d’analyse sphéroïque de co-culture tridimensionnaux est conçu pour imiter l’angiogenèse physiologique. Les sphéroïdes de co-culture sont formés par deux précurseurs de cellules vasculaires humaines, Les ECFC et les MSC, et incorporés dans le gel de collagène. Le nouveau système est efficace pour évaluer les modulateurs angiogéniques, et fournit des informations plus pertinentes à l’étude in vivo.
Abstract
Les études dans le domaine de l’angiogenèse ont été agressivement en croissance au cours des dernières décennies avec la reconnaissance que l’angiogenèse est une caractéristique de plus de 50 conditions pathologiques différentes, telles que la polyarthrite rhumatoïde, l’oculopathie, les maladies cardiovasculaires , et métasses tumorales. Pendant le développement de médicament d’angiogenèse, il est crucial d’employer des systèmes in vitro d’essai avec les types appropriés de cellules et les conditions appropriées pour refléter le processus physiologique d’angiogenèse. Pour surmonter les limites des systèmes actuels d’analyse d’angiogenèse in vitro utilisant principalement des cellules endothéliales, nous avons développé un système d’analyse de la co-culture en 3dimensions (3D) de co-culture. Les sphéroïdes de co-culture ont été produits par deux précurseurs de cellules vasculaires humaines, les cellules de formation de colonie séliale endothéliale (ECFC) et les cellules souches mésenchymales (MSCs) avec un rapport de 5 à 1. Les sphéroïdes eCFC-MSCs ont été incorporés dans la matrice de collagène de type I pour imiter l’environnement extracellulaire in vivo. Un enregistreur cellulaire en temps réel a été utilisé pour observer continuellement la progression de la germination angiogénique à partir de sphéroïdes pendant 24 h. La technique d’étiquetage fluorescent des cellules vivantes a également été appliquée pour observer la localisation de chaque type de cellule pendant la formation des germes. Le potentiel angiogénique a été quantifié en comptant le nombre de germes et en mesurant la longueur cumulative des germes générés par les sphéroïdes individuels. Cinq sphéroïdes choisis au hasard ont été analysés par groupe expérimental. Des expériences de comparaison ont démontré que les sphéroïdes ECFCs-MSCs ont montré un plus grand nombre de germes et une longueur cumulative de germes par rapport aux sphéroïdes eCFC seulement. Le bévacizumab, un inhibiteur de l’angiogenèse approuvé par la FDA, a été testé avec le système d’analyse sphéroïde de co-culture nouvellement développé pour vérifier son potentiel pour dépister les médicaments anti-angiogéniques. La valeur IC50 pour les sphéroïdes ECFCs-MSCs par rapport aux sphéroïdes ECFCs-seulement était plus proche de la concentration plasmatique efficace de bevacizumab obtenue à partir du modèle de souris de tumeur de xénogreffe. La présente étude suggère que le système d’analyse de l’angiogenèse sphéroïde 3D ECFs-MSCs est pertinent pour l’angiogenèse physiologique, et peut prédire une concentration efficace de plasma avant des expériences animales.
Introduction
Environ 500 millions de personnes dans le monde devraient bénéficier d’un traitement modulant de l’angiogenèse pour les maladies associées à la malformation vasculaire comme la polyarthrite rhumatoïde, l’oculopathie, les maladies cardiovasculaires et la métasose tumorale1. Ainsi, le développement de médicaments qui contrôlent l’angiogenèse est devenu un domaine de recherche important dans l’industrie pharmaceutique. Pendant le processus de développement de drogue, l’étude animale in vivo est nécessaire pour explorer les effets des candidats de drogue sur des fonctions physiologiques et des interactions systémiques entre les organes. Cependant, les questions d’éthique et de coût ont accru les préoccupations concernant les expériences animales2. Par conséquent, des systèmes d’analyse in vitro améliorés sont nécessaires pour obtenir des données plus précises et prévisibles menant à une meilleure prise de décision avant les expériences animales. Les essais actuels d’angiogenèse in vitro mesurent habituellement la prolifération, l’invasion, la migration ou la formation tubulaire de cellules endothéliales (EC) ensemoir dans des plaques de culture bidimensionnelles (2D)3. Ces essais d’angiogenèse 2D sont rapides, simples, quantitatifs et rentables, et ont contribué de manière significative à la découverte de médicaments modulation de l’angiogenèse. Cependant, plusieurs questions restent à améliorer.
Ces systèmes d’analyse in vitro 2D ne peuvent pas refléter des événements complexes en plusieurs étapes de l’angiogenèse qui se produit dans des conditions physiologiques in vivo, conduisant à des résultats inexacts qui causent des écarts entre les données d’essai in vitro et les résultats des essais cliniques4. Les conditions de culture 2D induisaient également le changement des phénotypes cellulaires. Par exemple, après la prolifération dans les plaques de culture 2D, les EC ont un phénotype cellulaire faible comme manifesté par l’expression réduite de CD34 et plusieurs signaux qui régissent les réponses cellulaires5,6. Pour surmonter les limites des systèmes d’analyse d’angiogenèse basés sur la culture 2D, des systèmes d’analyse sphéroïde tridimensionnaux (3D) ont été développés. Sprouting suivi par la formation de structure tubulaire à partir de sphéroïdes formés par ECs reflètent in vivo processus néo-vascularisation7,8. Ainsi, l’angiogenèse sphéroïde 3D a été considérée comme un système d’évaluation efficace pour le dépistage des médicaments potentiels pro ou anti-angiogenèse.
La plupart des analyses d’angiogenèse sphéroïde 3D n’utilisent que des EC, principalement des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) ou des cellules endothéliales microvasculaires cutanées humaines (HDMECs) pour se concentrer sur la réponse cellulaire des ECs pendant l’angiogenèse. Cependant, les capillaires sanguins sont composés de deux types de cellules : les CE et les péricytes. L’élaboration de l’interaction bidirectionnelle entre les EC et les péritéytes est essentielle pour une intégrité et une fonction vasculaires adéquates. Plusieurs maladies, telles que l’aVC héréditaire, la rétinopathie diabétique, et la malformation veineuse, sont associées à la densité altérée de périyte ou à l’attachement diminué de périyte à l’endothelium9. Les péricartes sont également connus comme un élément clé du processus angiogénique. Les péricartés sont recrutées pour stabiliser les structures nouvellement formées des navires par les EC. À cet égard, l’angiogenèse sphéroïde mono-culture n’incorpore pas de péridytes7,10. Par conséquent, les sphéroïdes de co-culture formés par des ECs et des péricartétes peuvent fournir une approche valable aux événements angiogéniques physiologiques plus étroitement imités.
La présente étude visait à mettre au point un analyse d’angiogenèse sphéroïde de co-culture 3D avec une combinaison de cellules de formation de colonies endothéliales humaines (CeFC) et de cellules souches mésenchymales (MSC) pour refléter plus étroitement l’angiogenèse in vivo. Le système sphéroïde de co-culture en tant qu’assemblage in vitro de représentation d’un vaisseau sanguin normal a été établi pour la première fois par Korff et autres en 200111. Ils ont combiné des HUVECs et des cellules lisses de muscle lissed d’artère ombilicale humaine (HUSMCs), et ont démontré que la co-culture de deux cellules vasculaires mûres a diminué le potentiel de germination. Les EC matures (HUVECs) sont connus pour perdre progressivement leur capacité à proliférer et différencier, ce qui affecte négativement leurs réponses d’angiogenèse12,13. Les cellules périvasculaires matures (HUSMCs) peuvent causer l’inactivation de cellules endothéliales par l’abrogation du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) réactivité11. La principale différence entre Korff et notre système sphéroïde co-culture est les types de cellules utilisées. Nous avons appliqué deux précurseurs vasculaires, Des ECFC et des MSC, pour établir un système approprié d’angiogenèse pour examiner et étudier les agents pro-ou-anti-angiogéniques. Les CEC sont le précurseur des CE. Les CEC ont une capacité de prolifération robuste par rapport aux CE matures14, ce qui permet de surmonter la limitation des CE. Les ECFC contribuent à la formation de nouveaux vaisseaux dans de nombreuses affections pathophysiologiques postnatales15,16,17. Les MSC sont des cellules souches pluripotentes qui ont la capacité de se différencier en péricartés, contribuant ainsi à l’angiogenèse18,19.
Dans les rapports précédents, les ECFC et les MSC ont montré des effets synergiques sur la formation in vitro de tube20,la néo-vascularisation in vivo21,22, et la reperfusion améliorée des tissus ischémiques23,24. Dans la présente étude, les ECFC et les MSC ont été utilisés pour former des sphéroïdes de co-culture et incorporés dans le gel de collagène de type I pour refléter un environnement 3D in vivo. Le collagène est considéré comme un des principaux constituants de la matrice extracellulaire (ECM) entourant les EC25. L’ECM joue un rôle essentiel dans la régulation du comportement cellulaire26. Le protocole d’analyse proposé ici peut être effectué facilement et rapidement en deux jours en utilisant des techniques de laboratoire communes. Pour un suivi efficace des cellules pendant le processus de germination, chaque type de cellule peut être étiqueté et surveillé de façon fluorescente à l’aide d’un enregistreur cellulaire en temps réel. Le nouveau système d’analyse d’angiogenèse sphéroïde de co-culture 3D est conçu pour augmenter la sensibilité pour évaluer les modulateurs angiogéniques potentiels et pour fournir des informations prévisibles avant l’étude in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La présente étude introduit un système d’analyse d’angiogenèse in vitro amélioré utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par deux progéniteurs de cellules vasculaires humaines, les CCEC et les MSC. Le système sphéroïde de co-culture peut imiter la formation de germes vasculaires in vivo, qui est par interaction et incorporation entre les cellules endothéliales et les péritéytes. Comparé à d’autres essais in vitro d’angiogenèse qui reflètent seulement l’angiogenèse ECs-négociée, ce système d’…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par une subvention (17172MFDS215) du Ministère de l’alimentation et de la sécurité des médicaments, la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIP) (2017R1A2B4005463), et le Programme de recherche scientifique fondamentale par l’intermédiaire du National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l’éducation (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
Referenzen
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
