Summary

ヒトおよびマウスの心筋標本からのマクロファージサブセットおよび間質細胞の分離

Published: December 17, 2019
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Summary

ここで提示するプロトコルは、酵素消化を介して単一細胞懸濁液を調製することにより、マクロファージおよび他の非免疫細胞の様々なサブセットをヒトおよびマウスの心筋から単離するプロトコルである。単離されたマクロファージのフローサイトメトリーベースの同定および特性評価のためのゲーティングスキームも提示される。

Abstract

マクロファージは、心臓の中で最も異種で豊富な免疫細胞集団を表し、心損傷後の炎症および修復応答を駆動する中心的存在である。マクロファージの様々なサブセットが心損傷後の免疫応答をどのように調整するかについては、研究の活発な領域である。ここで提示されるのは、健康で病気の個体から得られたマウスおよびヒト心筋標本からのマクロファージの抽出のために、私たちの研究室が日常的に行う簡単なプロトコルです。簡単に言えば、このプロトコルは、単一細胞懸濁液を生成するために心臓組織の酵素消化を伴い、続いて抗体染色、およびフローサイトメトリーを生成する。この技術は、並べ替えられた細胞に対して行われる機能アッセイ、バルクおよび単一細胞RNAシーケンシングに適しています。このプロトコルの主な利点は、そのシンプルさ、日々の変動を最小限に抑え、広い適用性を備えており、さまざまなマウスモデルおよびヒト疾患エンティティにわたるマクロファージの不均一性を調査することができます。

Introduction

マクロファージは心臓の中で最も豊富な免疫細胞型を表し、心損傷1、2、3、4に続く堅牢な炎症および修復応答を生成する上で重要な役割を果たす。以前、私たちのグループは、異なる発達起源5、6に由来するマウス心臓におけるマクロファージの2つの主要なサブセットを同定した。広く、組織常駐心臓マクロファージサブセットの異なる集団は、CCR2(C−Cモチーフケモカイン受容体2)の細胞表面発現に基づいて同定することができる。CCR2マクロファージ(細胞表面発現:CCR2-MHCIIおよびCCR2-MHCII)は胚起源(原始およびエリスロ骨髄系統)であり、自己再生することができ、恒主状態下で支配的な集団を表すことができる。居住者CCR2+マクロファージは、決定的な造血起源であり、循環単球からのリクルートを通じて維持され、恒静学的条件下でのマイナーな集団を表す。機能的には、CCR2マクロファージは最小限の炎症を発生し、冠動脈発生新生児心臓再生5、7に不可欠である。対照的に、CCR2+マクロファージは、心侮辱に続いて強固な炎症反応を開始し、心筋細胞損傷、左心室の有害な改造、および心不全進行8、9に寄与する。

最近、ヒト心筋には、CCR2-またはCCR2+8のいずれかとして同様に同定されたマクロファージの2つの異なるサブセットも含まれていることが示されている。遺伝子発現および機能解析は、ヒトCCR2-およびCCR2+マクロファージが機能的に発散したサブセットを表し、マウス心臓に見られるCCR2およびCCR2+マクロファージに機能的に類似していることを明らかにした。ヒトCCR2マクロファージは、IGF1、PDGF、Cyr61、およびHB-EGFを含む成長因子の堅牢なレベルを発現する。CCR2+マクロファージは、IL-1b、IL-6、CCL-2、CCL-7、およびTNF-aなどの炎症を促進するケモカインおよびサイトカインに富む。刺激されたCCR2+マクロファージは、培養中の炎症性サイトカインインターロイキン-1β(IL-1β)の著しく高いレベルを分泌する。これらのサブセットが、心損傷の文脈における組織修復および左心室(LV)改造にどのように寄与するかを、依然として活発な研究の領域である。

マウスおよびヒト心臓におけるマクロファージ不均一性のフローサイトメトリーベースの分析では、心臓組織を消化し、単一細胞懸濁液を生成し、続いてバルクRNAシーケンシング/単一細胞RNAシーケンシングや機能アッセイのための細胞の培養などのさらなる下流プロセスのためのフローサイトメトリック分析または細胞選別を生成する必要があります。マウスの心臓から単一の細胞懸濁液を作るための元のプロトコルは、最初にナレンドルフらのナレンドルフグループによって報告されました 200710.私たちの研究室は、ヒト心筋からマクロファージを抽出するためにプロトコルを適応させ、改変しました。同じプロトコルを使用するが、染色およびゲーティングスキームにわずかな変更を加えて、ヒト心筋からの間質細胞のCD45収穫することができる。ここで提示される、テキストおよびビデオにおいて、ヒト心筋からのマクロファージまたは間質の抽出のために日常的に行われるプロトコルである。

心臓組織標本は、拡張型心筋症(DCM:特発性または家族性)または虚血性心筋症(ICM)を受けた左心室補助装置(LVAD)移植または心臓移植を有する成人患者から得られる。励起された心臓またはLVADコアは、消化手順を開始する前に冷たい生理食リンで血管内に浸透する。瘢痕化または脂肪組織浸潤の程度の観点から決定される組織標本の「品質」は、マクロファージの収率に大きく影響を与えることができることに注意することが重要です。瘢痕の広い領域を有する心臓標本は、はるかに低い細胞収率を有し、所望の下流の分析方法がインビトロ細胞培養を必要とする場合に深刻な技術的制限を提起することができる。

Protocol

提示されたプロトコルは、セントルイス機関審査委員会(#201305086)のワシントン大学によって承認されています。すべての被験者は、サンプル収集の前にインフォームド・コンセントを提供し、実験は承認された研究プロトコルに従って行われる。提示されたプロトコルは、ワシントン大学医学部の制度的動物ケアと使用委員会の承認を得て行われ、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに?…

Representative Results

記載されたプロトコルは、マウスおよびヒト心筋からのマクロファージの分離を可能にする。同じプロトコルを使用して、異なる染色およびゲーティング戦略を有するが、間質細胞はまた、ヒト心筋から収穫することができる。ここで提示されたFACSの結果は、BD LSRIIまたはBD FACS ARIA IIIプラットフォームのいずれかで取得されました。補償制御は、染色された脾細胞か…

Discussion

このプロトコルは、ヒト心筋からの種々のマクロファージサブセットの抽出を可能にする。プロトコルはシンプルで、FACS分析の準備が整った単一細胞懸濁液の準備に3~4時間かかります。プロトコルの実行は比較的簡単ですが、変動を最小限に抑える技術的な側面を考慮する必要があります。第一に、最適な細胞生存率を得るには、ヒト組織をタイムリーに働かすことができます。細胞死を最…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトは、ワシントン大学の小児発見研究所とセントルイス小児病院(CH-II-2015-462、CH-II-2017-628)、バーンズ・ユダヤ病院財団(8038-88)、NHLBI(R01)から提供された資金によって可能になりました。HL138466、 R01 HL139714)。K.J.L.は、NIH K08 HL123519およびバロウズウェルカムファンド(1014782)によってサポートされています。

Materials

15 mL Conocal Tubes Thermo Fisher 14-959-53A
40 µm Cell Strainers Thermo Fisher 50-828-736
50 mL Conical Tubes Thermo Fisher 352098
ACK Lysis Buffer Gibco A10492-01
Bovine Serum Albumin Sigma A2058
Collagenase 1 Sigma C0130-1G
DAPI Thermo Fisher D1306
DMEM 1x Gibco 11965-084
DNAse 1 Sigma D4527-20KU
DRAQ5 Thermo Fisher 62251
EDTA 0.5M pH 8 Corning 46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)
Fetal Bovine Serum Gibco A3840201
Forceps VWR 82027-406
HBSS 1x Gibco 14175-079
Hemostats VWR 63042-052
Hyaluronidase type 1-s Sigma H3506-500MG
PBS 1x Gibco 14190-136
Petridishes Thermo Fisher 172931
Razor Blade VWR 55411-050
Scissors VWR 82027-578

Referenzen

  1. Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
  2. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  3. Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
  4. Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  5. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  6. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  7. Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
  8. Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
  9. Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
  10. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).

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Diesen Artikel zitieren
Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens. J. Vis. Exp. (154), e60015, doi:10.3791/60015 (2019).

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