Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

O Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, predominante principalmente na América Latina¹. T. cruzi tem estágios distintos do ciclo de vida enquanto viaja entre um vetor do inseto e um anfitrião mamífero². T. cruzi Replica como um atividade no intestino médio de um bug triatomíneo sugador de sangue e diferencia-se em um tripomastigota metacíclicos infeccioso em seu intestino posterior antes de ser depositado em um anfitrião humano ou animal. Uma vez que o tripomastigota entra no corpo hospedeiro através do local da mordida ou através de uma membrana mucosa, o parasita invade uma célula hospedeira e se transforma em uma forma redonda flagella-less chamada um amastigote. O amastigotas Replica dentro da célula hospedeira e, eventualmente, diferencia-se em trypomastigote, que explode fora da célula hospedeira e entra na corrente sanguínea para infectar outra célula hospedeira.

Como os agentes quimioterapêuticos atualmente disponíveis, o Benznidazol e o Nifurtimox, causam efeitos colaterais adversos e são ineficazes na fase crônica da doença³, é de grande interesse identificar novos alvos de drogas contra o T. cruzi. Nos últimos anos, o sistema CRISPR/Cas9 tornou-se uma poderosa ferramenta para efetivamente realizar nocaute genético em T. cruzi, seja por transfecção de plasmídeo (s) separado ou único contendo Grna e CAS9⁴, por expressão estável de Cas9 e subsequente introdução de grna^5,6,7 ou modelo de transcrição de grna⁸, ou por eletroporação do complexo pré-formado de grna/Cas9 RNP^7,9. Este avanço tecnológico é altamente antecipado para acelerar a pesquisa-alvo de drogas na doença de Chagas.

Para prosseguir com o desenvolvimento da droga, é crucial validar a essencialidade do gene alvo ou a eficácia dos compostos candidatos à droga na amastigotas de T. cruzi, pois é a fase de replicação do parasita no hospedeiro de mamíferos. No entanto, esta é uma tarefa desafiadora, porque amastigotas não podem ser manipuladas diretamente devido à presença de uma célula hospedeira obstrutiva. Em Leishmania, um parasita de protozoário intimamente relacionado ao T. cruzi, um método de cultivo de amastigotas axênico foi desenvolvido e tem sido utilizado em ensaios de triagem de fármacos^{10,11,12, 13}. embora existam algumas discrepâncias na suscetibilidade a compostos entre amastigotas axênicas e amastigotas intracelulares¹⁴, a capacidade de manter a cultura axênica, no entanto, fornece valiosas ferramentas experimentais para estudar a biologia básica do estágio clinicamente relevante de Leishmania^15,16. No caso do T. cruzi, literaturas quanto à presença de amastigotas extracelulares (ea)¹⁷ e produção in vitro de ea^17,18,19 datam de décadas atrás. Além disso, a EA é conhecida por ter uma capacidade infecciosa²⁰, embora menos do que a do trypomastigote, e o mecanismo de invasão do hospedeiro amastigota tem sido elucidado nos últimos anos (revisado por Bonfim-Melo et al.²¹). No entanto, diferentemente da Leishmania, a ea não tinha sido utilizada como ferramenta experimental no T. cruzi, principalmente porque a ea tinha sido considerada como um parasita intracelular obrigatório e, portanto, não tinha sido considerada como “forma replicativa” em uma prática Sentido.

Recentemente, nosso grupo propôs utilizar a EA de T. cruzi como uma cultura axênica temporal²². Amastigotas de T. cruzi tulahuen estirpe pode replicar livre de células hospedeiras em meio iluminado a 37 ° c por até 10 dias sem grande deterioração ou perda de propriedades semelhantes a amastigotas. Durante o período de crescimento livre de hospedeiro, a EA foi utilizada com sucesso para expressão gênica exógena por eletroporação convencional, ensaio de titulação de fármacos com compostos tripanociais e nocaute de CRISPR/Cas9, seguido de monitoramento do fenótipo de crescimento. Neste relatório, nós descrevemos o protocolo detalhado para produzir in vitro o ea derivado e para utilizar o amastigotas axênicos em experimentos do nocaute.