Sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici
Summary
Presentiamo un metodo utile per la sintesi e purificazione e depurazione esulla scala di specifici enantiomeri e regioisori di epossido di acido aracidonico (AA), acido docosaesaenoico (DHA) e acido eicosapentaeno (EPA) con l’uso di un citocromo batterico P450 enzima (BM3).
Abstract
I metaboliti epossidizzati di vari acidi grassi polinsaturi (PUFA), rititi acidi grassi epossidici, hanno una vasta gamma di ruoli nella fisiologia umana. Questi metaboliti sono prodotti endogenamente dalla classe citocromatica P450 degli enzimi. A causa dei loro effetti biologici diversi e potenti, c’è un notevole interesse nello studio di questi metaboliti. Determinare i ruoli unici di questi metaboliti nel corpo è un compito difficile, in quanto gli acidi grassi epossidici devono prima essere ottenuti in quantità significative e con alta purezza. Ottenere composti da fonti naturali è spesso laborioso, e idrolasi epossido solubili (sEH) rapidamente idrolizzare i metaboliti. D’altra parte, ottenere questi metaboliti tramite reazioni chimiche è molto inefficiente, a causa della difficoltà di ottenere regioisomeri e enantiomeri puri, bassi rendimenti e vaste (e costose) purifiche. Qui, presentiamo un’efficiente sintesi enzimatica di 19(S), 20 (R)- e 16(S), 17(R)-epoxydocosatrapaenoiche acids (EDP) da DHA via epossidazione con BM3, un enzima batterico CYP450 isolato originariamente da Bacillus megaterium (che è prontamente espresso in Escherichia coli). La caratterizzazione e la determinazione della purezza vengono eseguite con spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Questa procedura illustra i benefici della sintesi enzimatica dei metaboliti PUFA epoxy ed è applicabile all’epossidazione di altri acidi grassi, tra cui l’acido aracidonico (AA) e l’acido eicosapentaenoico (EPA) per produrre l’analogo epoxyeicosanoico acidi (EET) e gli acidi epossidicosaetui (EEQ), rispettivamente.
Introduction
Come interesse per il ruolo che gli acidi grassi polinsaturi (in particolare gli acidi grassi polinsaturi omega-3 e omega-6) è cresciuto negli ultimi anni, i ricercatori hanno preso atto della vasta gamma di vantaggi interessanti che i loro metaboliti mostra. In particolare, i metaboliti dell’acido grasso epossidico prodotti dalla classe citocromatica P450 degli enzimi sono stati un grande punto focale. Ad esempio, molti epossido di PUFA, tra cui gli acidi epossieicosachichi (EET), gli acidi epoxydocosatrapaenoici (EDP) e gli acidi epossirossitetraenoici (EEQ), svolgono un ruolo critico nella regolazione della pressione sanguigna e dell’infiammazione1,2 , 3 (COM del nome , 4 DEL psu’ , 5. È interessante notare che gli enantiomeri specifici e i regioisomeri degli epossido di AA e EPA sono noti per avere effetti variabili sull’vasoconstriction6,7. Mentre gli effetti fisiologici degli enantiomeri e dei regioisomeri degli EET e degli EEQ sono stati documentati, si sa poco sull’effetto degli analoghi acidi essidomiomiatori (EDP) formati dal DHA. L’uso diffuso dell’olio di pesce8, che è ricco sia di EPA che di DHA, ha suscitato interesse anche per gli EDP9. I benefici di questi integratori sono creduti per essere in parte a causa dei metaboliti DHA a valle (16,17-EDP e 19,20-EDP essendo il più abbondante) perché in vivo livelli di EDP si coordinano molto bene con la quantità di DHA nella dieta10, 11.
Lo studio dei meccanismi e degli obiettivi di questi acidi grassi epossidici mediante metabolomica, biologia chimica e altri metodi si è dimostrato impegnativo, in parte perché esistono come miscele di regio- e stereo-isomeri, e un metodo per ottenere quantità pure del anti-enantiomeri e regioisomers. I mezzi convenzionali per sintetizzare chimicamente questi composti si sono dimostrati inefficaci. L’uso di perossididi come l’acido meta-cloroperoxybenzoico per l’epossidica ha molti inconvenienti, in particolare la mancanza di selettività dell’epossidazione, che richiede una purificazione costosa e scrupolosa di singoli regiosori e enantiomeri. La sintesi totale dei metaboliti DHA ed EPA è possibile, ma soffre anche di inconvenienti che lo rendono poco pratico per la sintesi su larga scala come i costi elevati e le basse rese12,13. Una produzione complessiva efficiente può essere realizzata con sintesi enzimatica, poiché le reazioni enzimatiche sono regio- e stereoselettive14. Gli studi dimostrano che l’epossidizzazione epossimatica epossimatica di AA ed EPA (con BM3) è sia regiosesesese che enantiosese15,16,17,18, ma questa procedura non è stata testata con DHA, o su un grande scala. L’obiettivo generale del nostro metodo era quello di scalare e ottimizzare questa epossidazione chemiozimatica per produrre rapidamente quantità significative di acidi grassi epossidici puri come loro antiantiomeri individuali. Utilizzando il metodo qui presentato, i ricercatori hanno accesso a una strategia semplice ed economica per la sintesi di EDP e altri metaboliti epossidici PUFA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo qui un metodo operativamente semplice ed economico per preparare i due metaboliti epossidici più abbondanti del DHA – 19,20 e 16,17-EDP. Questi acidi grassi epossidici possono essere preparati in forma altamente enantiopure (come il loro S,R-isomers) utilizzando l’enzima BM3 di tipo selvatico. Diversi punti critici che possono essere utilizzati per la risoluzione dei problemi, e l’estensione del nostro metodo per la preparazione di metaboliti epossidi enantiopure di AA ed EPA, sono descritti di s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è finanziato da R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fondi di avvio dalla Michigan State University. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jun Yang (Università della California a Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) per l’assistenza con l’ottimizzazione della reazione enzimatica, e il Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectromometria e Metabolomics Facility) per assistenza con l’acquisizione dei dati HRMS.
Materials
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
Referenzen
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