Enzymatische Synthese von epoxidierten Metaboliten von Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic und Arachidonsäuren
Summary
Wir präsentieren eine Methode, die für die großflächige enzymatische Synthese und Reinigung spezifischer Enantiomere und Regioisomere von Epoxiden von Arachidonsäure (AA), Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) unter Verwendung eines bakteriellen Cytochroms nützlich ist. P450-Enzym (BM3).
Abstract
Die epoxidierten Metaboliten verschiedener mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFAs), die als Epoxidfettsäuren bezeichnet werden, haben eine Vielzahl von Rollen in der menschlichen Physiologie. Diese Metaboliten werden endogen durch die Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen hergestellt. Aufgrund ihrer vielfältigen und starken biologischen Wirkung besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung dieser Metaboliten. Die Bestimmung der einzigartigen Rolle dieser Metaboliten im Körper ist eine schwierige Aufgabe, da die Epoxidfettsäuren zunächst in signifikanten Mengen und mit hoher Reinheit erhalten werden müssen. Die Gewinnung von Verbindungen aus natürlichen Quellen ist oft arbeitsintensiv, und lösliche Epoxidhydrolasen (sEH) hydrolysieren die Metaboliten schnell. Andererseits ist die Erlangung dieser Metaboliten über chemische Reaktionen sehr ineffizient, da es schwierig ist, reine Regioisomere und Enantiomere, niedrige Erträge und eine umfangreiche (und teure) Reinigung zu erhalten. Hier präsentieren wir eine effiziente enzymatische Synthese von 19(S), 20(R)- und 16(S),17(R)-epoxydocosapentaennoic acids (EDPs) aus DHA via Epoxidation mit BM3, einem bakteriellen CYP450-Enzym, das ursprünglich aus Bacillus isoliert wurde Megaterium (das leicht in Escherichia coliausgedrückt wird). Die Charakterisierung und Bestimmung der Reinheit erfolgt mit DerKernspinresonanzspektroskopie (NMR), der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Massenspektrometrie (MS). Dieses Verfahren veranschaulicht die Vorteile der enzymatischen Synthese von PUFA-Epoxid-Metaboliten und ist auf die Epoxidation anderer Fettsäuren anwendbar, einschließlich Arachidonsäure (AA) und Eicosapentaensäure (EPA), um die analoge epoxyeicosatrienoische Säuren (EETs) bzw. Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs).
Introduction
Da das Interesse an der Rolle, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren (insbesondere Omega-3 und Omega-6 mehrfach ungesättigte Fettsäuren) in der menschlichen Biologie spielen, in den letzten Jahren zugenommen hat, haben Forscher die breite Palette attraktiver Vorteile, die ihre Metaboliten ausstellen. Insbesondere Epoxid-Fettsäure-Metaboliten, die von der Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen produziert wurden, waren ein großer Schwerpunkt. Beispielsweise spielen viele PUFA-Epoxide, einschließlich Epoxyeicosatrienosäuren (EETs), Epoxydocosapentaensäuren (EDP) und Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs), eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Blutdruck und Entzündungen1,2 , 3 , 4 , 5. Interessanterweise haben die spezifischen Enantiomere und Regioisomere von AA- und EPA-Epoxiden bekanntlich unterschiedliche Auswirkungen auf die Vasokonstriktion6,7. Während die physiologischen Wirkungen der Enantiomere und Regioisomere von EETs und EEQs dokumentiert sind, ist wenig über die Wirkung der analogen Epoxidokanosäuren (EDP) aus DHA bekannt. Die weitverbreitete Verwendung von Fischöl8, das sowohl an EPA als auch an DHA reich ist, hat ebenfalls das Interesse an DEN EDP9geweckt. Die Vorteile dieser Ergänzungen werden geglaubt, um teilweise aufgrund der nachgelagerten DHA-Metaboliten (16,17-EDP und 19,20-EDP ist die am häufigsten vorkommende), weil in vivo Niveaus von EDP sehr gut mit der Menge an DHA in der Ernährung10 , 11.
Die Untersuchung der Mechanismen und Ziele dieser Epoxidfettsäuren durch Metabolomik, chemische Biologie und andere Methoden hat sich als herausforderunglich erwiesen, zum Teil, weil sie als Mischungen von Regio- und Stereo-Isomeren existieren, und eine Methode zur Gewinnung reiner Mengen der Enantiomere und Regioisomer erforderlich sind. Herkömmliche Mittel zur chemischen Synthese dieser Verbindungen haben sich als unwirksam erwiesen. Die Verwendung von Peroxysäuren wie Meta-Chloroperoxybenzoesäure für die Epoxidation hat viele Nachteile, insbesondere den Mangel an Epoxidationsselektivität, der eine teure und sorgfältige Reinigung einzelner Regioisomere und Enantiomere erfordert. Die Gesamtsynthese von DHA- und EPA-Metaboliten ist möglich, leidet aber auch unter Nachteilen, die es für großflächige Syntheseen wie hohe Kosten und niedrige Erträge12,13machen. Effiziente Gesamtproduktion kann mit enzymatischer Synthese erreicht werden, da enzymatische Reaktionen regio- und stereoselektiv sind14. Studien zeigen, dass die enzymatische Epoxidation von AA und EPA (mit BM3) sowohl regioselektiv als auch enantioselektivist 15,16,17,18, aber dieses Verfahren wurde nicht mit DHA oder an einem großen skala. Das übergeordnete Ziel unserer Methode war es, diese chemoenzymatische Epoxidation zu skalieren und zu optimieren, um schnell signifikante Mengen an reinen Epoxidfettsäuren als ihre individuellen Enantiomere zu produzieren. Mit der hier vorgestellten Methode haben Forscher Zugang zu einer einfachen und kostengünstigen Strategie für die Synthese von EDV und anderen PUFA-Epoxidmetaboliten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren hier eine operativ einfache und kostengünstige Methode zur Vorbereitung der beiden am häufigsten vorkommenden Epoxidmetaboliten von DHA – 19,20 und 16,17-EDP. Diese Epoxidfettsäuren können in hochenantiopurer (als S,R-Isomere) Form mit Wildtyp-BM3-Enzym hergestellt werden. Im Folgenden werden mehrere kritische Punkte beschrieben, die zur Fehlerbehebung verwendet werden können, und die Erweiterung unserer Methode zur Herstellung von enantiopuren Epoxidmetaboliten von AA und EPA.
<p cla…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) und Startup-Fonds der Michigan State University finanziert. Die Autoren danken Dr. Jun Yang (University of California at Davis) und Lalitha Karchalla (Michigan State University) für die Unterstützung bei der Optimierung der enzymatischen Reaktion und Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) Unterstützung bei der HRMS-Datenerfassung.
Materials
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
Referenzen
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