L’obiettivo di questo articolo è quello di delineare i passi necessari per la generazione di fibrille da alfa-sinucleina monomerica, successivo controllo di qualità, e l’uso dei fibrili preformati in vivo.
L’uso del modello in vivo di fibrille alfa-sinucleina preformato (α-SYN PFF) della sinucleinopatia sta guadagnando popolarità tra i ricercatori che mirano a modellare la sinucleinopatia della malattia di Parkinson e la degenerazione nigrostriatale. La standardizzazione della generazione di α-SYN PFF e dell’applicazione in vivo è critica al fine di garantire una patologia α-SYN consistente e robusta. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di fibrille da monomerica α-SYN, fasi di controllo della qualità post-fibrilization, e parametri suggeriti per l’iniezione neurochirurgica di successo di α-SYN PFFs in ratti o topi. A partire dall’α-SYN monomerica, la fibrilizzazione si verifica in un periodo di incubazione di 7 giorni, scuotendo in condizioni ottimali di buffer, concentrazione e temperatura. Il controllo della qualità post-fibrilizzazione è valutato dalla presenza di fibrille pellettiche attraverso il saggio di sedimentazione, la formazione di conformazione amiloide nelle fibrille con un saggio di tioflavina T, e la visualizzazione microscopica elettronica dei fibrili. Considerando che la convalida corretta utilizzando questi saggi è necessaria per il successo, non sono sufficienti a garantire che i PFFs seminino inclusioni α-SYN nei neuroni, in quanto tale attività di aggregazione di ciascun lotto PFF deve essere testata nella coltura cellulare o in coorti pilota di animali. Prima dell’uso, i PFFs devono essere sonicati in condizioni esattamente standardizzate, seguiti da un esame utilizzando la microscopia elettronica o la dispersione luminosa dinamica per confermare che le lunghezze di fibrille sono all’interno di una gamma di dimensioni ottimali, con una lunghezza media di 50 Nm. I PFFs possono quindi essere aggiunti ai supporti di coltura cellulare o utilizzati negli animali. La patologia rilevabile mediante immunocolorazione per l’α-SYN fosforilato (Psyn; serina 129) è apparente giorni o settimane dopo nei modelli di coltura cellulare e roditore, rispettivamente.
Il morbo di Parkinson (PD) è caratterizzato principalmente da due importanti caratteristiche patologiche: la patologia alfa-sinucleina (α-SYN) diffusa e progressiva e la degenerazione nigrostriatale. Dopo l’iniezione in topi o ratti di tipo wildtype, le fibrille α-SYN preformate (PFFs) inducono un progressivo accumulo di α-SYN patologico, che può comportare una degenerazione prolungata dei neuroni della dopamina di sostanza nigra pars compacta (SNpc) nel corso di molti mesi, così come i deficit sensomotoria1,2,3,4,5,6. I neuroni sono esposti a α-SYN fibrils, sia tramite iniezione intracerebrale diretta o aggiunti ai media dei neuroni coltivati. Quando i pffs sono presi nei neuroni, i pffs agiscono per “seme” la formazione di inclusioni attraverso il templating, e l’accumulo di α-SYN endogeno in inclusioni fosforilate1,7,8, 9. il Inclusioni condividono proprietà simili a corpi di Lewy: contenenti α-SYN fosforilato a serina 129 (pSyn), ubiquitina, e P62; possedere strutture quaternarie amiloidi come mostrato con colorazione Tioflavina positiva; e sono resistenti alla proteinasi K digestione1,3,5,7,8,9,10,11, 12. per la L’esposizione PFF conduce alla formazione di inclusione α-SYN in neuroni primari e alcuni immortalati nella cultura, così come topi, ratti e primati non umani in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. È importante notare che i PFFs non porteranno alla formazione di inclusione α-SYN in tutti i modelli di coltura cellulare e alcuni neuroni coltivati saranno seme meglio di altri.
Un’altra caratteristica importante del modello in vivo α-SYN PFF è la distinta fase patologica sequenziale che emerge nel corso di diversi mesi. Nei roditori, a seguito di iniezione intrastriatale, la formazione di inclusione α-SYN generalmente picchi all’interno del SNpc e molte regioni corticali entro 1-2 mesi. Questo picco di aggregazione è seguito da degenerazione nigrostriatal ≈ 2-4 mesi più tardi1,3,5. Queste distinte fasi patologiche forniscono ai ricercatori la piattaforma con cui studiare e sviluppare strategie che 1) diminuire l’aggregazione α-SYN, 2) chiare inclusioni α-SYN già formate, e/o 3) prevenire la successiva neurodegenerazione. Il modello PFF offre vantaggi e svantaggi distinti rispetto ai modelli iperespressivi α-SYN, transgenici e a vettori virali mediati da neurotossicant, come precedentemente esaminato6. La scelta del modello o dell’approccio da adottare dovrebbe essere determinata dal modello che meglio si adatta alla domanda che gli investigatori chiedono.
Anche se il modello PFF è stato utilizzato con successo da molti laboratori, ci sono ancora gruppi che hanno sperimentato incongruenze con la generazione di fibrille e producendo coerente α-SYN patologia14. Esempi di incongruenze variano da PFFs che producono poca o nessuna patologia α-SYN, batch per l’efficienza di semina batch, e anche il fallimento di fibrille da formare. Pertanto, la standardizzazione della generazione di α-SYN PFF e dell’applicazione in vivo è critica al fine di consentire interpretazioni accurate sull’impatto di nuovi interventi terapeutici. Il seguente protocollo delinea i passi necessari per la generazione di PFFs da monomeri α-SYN, il controllo di qualità in vitro dei PFFs una volta formati, la sonicazione e la misurazione di PFFs prima dell’uso, e suggerimenti per facilitare l’iniezione in vivo di successo di PFFs in ratti o topi.
La produzione di PFFs α-SYN in grado di seminare i neuroni e portare a inclusioni simili al corpo di Lewy dipende da molteplici fattori e passaggi. Un fattore critico è che i monomeri utilizzati per la generazione di fibrille devono essere specificamente formulati per la fibrilizzazione4,9,14,15. Se i monomeri non sono formulati per la fibrilizzazione, le fibrille non possono formarsi o le fibrille che si formano non possono produrre una patologia α-SYN. Analogamente, il tampone che i monomeri influenzano anche la fibrilizzazione. Come tale, per i migliori risultati, la concentrazione di sale dovrebbe essere di circa 100 mM di NaCl e pH tra 7,0 e 7,3. Un primo passo che introduce la variabilità è il metodo con cui viene determinato il contenuto proteico iniziale, con la misurazione a A280 che può produrre risultati più accurati e quindi è il metodo preferito. La discrepanza nella concentrazione proteica può diminuire l’efficacia del processo di fibrilizzazione, così come alterare la concentrazione presunta del PFF utilizzata negli esperimenti. Entrambi potrebbero comportare una diminuzione dell’efficienza di semina e delle variazioni di lotto tra gli esperimenti.
Le fasi iniziali di controllo della qualità confermeranno le caratteristiche critiche dei PFFs, in particolare che hanno una conformazione fibrillaria (microscopia elettronica), contengono strutture amiloidi (saggio Tioflavina T) e sono pelletable (saggio di sedimentazione). È importante notare che i risultati del saggio tioflavin T oscilleranno con il tempo e non sono una misura diretta della quantità di strutture amiloidi presenti, piuttosto, il saggio di tioflavina T deve essere usato solo come indicatore della presenza di strutture amiloidi all’interno il campione. Thioflavin T è tipicamente usato in saggi in vitro, come il suddetto saggio per mostrare che le fibrille contengono strutture amiloidi. In alternativa, Tioflavina S è usato nei tessuti per rilevare strutture amiloidi, come mostrato in Figura 7. Per quanto riguarda il saggio di sedimentazione, i risultati mostrano solo che i PFFs si trovano prevalentemente nella frazione pelletable. Mentre i campioni vengono eseguiti in condizioni di denaturazione, una singola banda prominente di circa 14 kDa, la dimensione dei monomeri α-SYN, è presente sui gel. Questo è diverso dalle bande multiple presenti a pesi molecolari più elevati che ci si aspetta con i PFFs se è stato utilizzato un gel nativo o non denaturante. Infine, il superamento di tutte queste fasi iniziali di controllo della qualità non garantisce l’attività di semina dell’inclusione α-SYN. Per questo motivo, esperimenti di coltura cellulare o una piccola coorte di animali iniettati chirurgicamente devono essere utilizzati per testare l’efficacia dei PFFs prima dell’uso in esperimenti più grandi.
Sonicazione è un passo cruciale nel processo e parametri saranno diversi a seconda del modello di sonicatore utilizzato. I parametri di sonicazione devono essere applicati e verificati per mostrare che sono stati prodotti frammenti di PFF corti. Dimensione fibril ha cuscinetto sulla semina, con fibrille più brevi semina più efficiente. Anche se i semi di fibrille più brevi più efficiente, questo altipiani effetto e la lunghezza ottimale pff è di circa 50 Nm4,18. È anche importante non sovra-Sonicare i campioni ed esporre i PFFs a calore eccessivo, in quanto questo può diminuire l’efficienza di semina. Questi PFFs sonicati devono essere testati per l’efficacia nella coltura di piccole cellule o negli esperimenti in vivo prima dell’uso in esperimenti su più grandi dimensioni. Poiché diverse sessioni di sonicazione hanno il potenziale per introdurre la variabilità, i gruppi di trattamento sperimentale dovrebbero essere pianificati di conseguenza.
Quando si consegnano i pffs in vivo, la localizzazione del sito (i) di iniezione e la quantità totale di pffs utilizzati possono influenzare il numero di neuroni che svilupperanno inclusioni, nonché l’entità della neurodegenerazione7,14. Le coordinate del protocollo forniscono un punto di partenza, ma devono essere testate all’interno del laboratorio per garantire che la regione target desiderata sviluppi la patologia α-SYN prima dell’uso in esperimenti su larga scala. Se lo si desidera, il tracciamento delle tinte o delle perle fluorescenti può essere utilizzato come metodo per testare il targeting regionale prima di utilizzare i PFFs. La quantità di pffs utilizzata in vivo varia tra i gruppi, con la maggior parte dei gruppi che utilizzano un totale compreso tra 5 e 20 μg di pffs in uno o diviso tra due siti di iniezione1,2,3,4,5 , 6 il , 7 il , 14. Poiché il numero di siti di iniezione, l’ubicazione dei siti di iniezione e la quantità di pffs iniettate possono influire sui risultati e sulla progressione della sinucleinopatia, i risultati a valle dei parametri utilizzati devono essere caratterizzati prima di utilizzare il modello per testare potenziali interventi o esaminare le caratteristiche temporali del modello.
Quando si seleziona un modello da utilizzare per testare le terapie o studiare la progressione della malattia, il modello utilizzato deve essere selezionato per rispondere meglio alla domanda posta. Non tutti i modelli saranno in possesso di alcune caratteristiche di malattia di PD, o offrire il lasso di tempo necessario per testare i potenziali interventi. Il modello PFF ricapitolizza le caratteristiche principali della PD, come la patologia α-SYN e la neurodegenerazione, e può portare a modeste riduzioni motorie. Il modello offre un corso temporale prevedibile e prolungato, dove le inclusioni si formano mesi prima della neurodegenerazione. Ciò consente ai ricercatori di esaminare e sfruttare le diverse fasi durante la progressione prolungata della sinucleinopatia. L’uso attuale e futuro del modello in generale dovrebbe essere vantaggioso nello studio della progressione della malattia e dello sviluppo di nuove terapie.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dalla Fondazione Michael J. Fox, l’Istituto nazionale di disordini neurologici e ictus (NS099416) e il Weston Brain Institute.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |