L’objectif de cet article est de décrire les étapes requises pour la génération de fibrilles à partir de l’alpha-synucléine monomère, le contrôle de qualité ultérieur, et l’utilisation des fibrilles préformées in vivo.
L’utilisation de l’alpha-synucléine in vivo du modèle préformé de fibrilles (α-syn PFF) de la synucléinopathie gagne en popularité parmi les chercheurs visant à modéliser la synucléinopathie de la maladie de Parkinson et la dégénérescence nigrostriatale. La normalisation de la génération de PFF α-syn et de l’application in vivo est essentielle afin d’assurer une pathologie α-syn cohérente et robuste. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la génération de fibrilles à partir des étapes monomères α-syn, post-fibrilisation de contrôle de qualité, et suggéré des paramètres pour l’injection neurochirurgicale réussie de PFFs α-syn dans des rats ou des souris. En commençant par l’α-syn monomérique, la fibrilisation se produit sur une période d’incubation de 7 jours tout en secouant à des conditions de tampon optimales, la concentration et la température. Le contrôle de la qualité post-fibrilisation est évalué par la présence de fibrilles partir par dosage de sédimentation, la formation de conformation amyloïde dans les fibrilles avec un dosage de thioflavine T, et la visualisation microscopique des fibrilles par microscopie électronique. Alors que la validation réussie à l’aide de ces essais est nécessaire pour le succès, ils ne sont pas suffisants pour garantir que les PFFs ensemencer des inclusions α-syn dans les neurones, car cette activité d’agrégation de chaque lot de PFF doit être testée dans la culture cellulaire ou dans les cohortes animales pilotes. Avant l’utilisation, les PFFs doivent être sonicés dans des conditions parfaitement normalisées, suivies d’un examen à l’aide de la microscopie électronique ou de la diffusion dynamique de la lumière pour confirmer que les longueurs de fibrilles sont dans une plage de taille optimale, avec une longueur moyenne de 50 nm. Les PFFs peuvent ensuite être ajoutés aux milieux de culture cellulaire ou utilisés chez les animaux. La pathologie détectable par immunocoloration pour l’α-syn phosphorylée (pSYN; sérine 129) est apparente jours ou semaines plus tard dans la culture cellulaire et les modèles de rongeurs, respectivement.
La maladie de Parkinson (MP) est principalement caractérisée post-mortem par deux caractéristiques pathologiques majeures: la pathologie généralisée et progressive de l’alpha-synucléine (α-SYN), et la dégénérescence nigrostriatale. Après l’injection dans des souris ou des rats sauvages, les fibrilles α-syn préformées (PFFs) induisent une accumulation progressive de α-syn pathologique, ce qui peut entraîner une dégénérescence prolongée des neurones de la dopamine de substantia nigra pars compacta (SNpc) au cours de plusieurs mois, ainsi que les déficits sensorimoteurs1,2,3,4,5,6. Les neurones sont exposés à des fibrilles α-syn, soit par injection intracérébrale directe, soit ajoutées aux milieux des neurones cultivés. Lorsque les PFFS sont pris dans les neurones, les PFFS agissent pour «semer» la formation d’inclusions par le biais de modèles, et l’accumulation d’α-syn endogène dans les inclusions phosphorylées1,7,8, le 9. Les inclusions partagent des propriétés similaires aux corps de Lewy: contenant de l’α-syn phosphorylée à la sérine 129 (pSYN), à l’ubiquitine et à la p62; posséder des structures quaternaires amyloïdes, comme le montre la coloration positive de la thioflavine; et résistent à la digestion de la protéinase K1,3,5,7,8,9,10,11, le 12. L’exposition au PFF conduit à la formation de l’inclusion α-syn dans les neurones primaires et certains neuronaux immortalisés dans la culture, ainsi que chez les souris, les rats et les primates non humains in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Il est important de noter que les PFFs ne mèneront pas à la formation d’inclusion α-syn dans tous les modèles de culture cellulaire et que certains neurones cultivés seront mieux semences que d’autres.
Une autre caractéristique importante du modèle in vivo α-syn PFF est les phases pathologiques séquentielles distinctes qui émergent sur plusieurs mois. Chez les rongeurs, après l’injection intrastriatale, la formation d’inclusion α-syn atteint généralement des pics dans le SNpc et dans de nombreuses régions corticales dans les 1-2 mois. Ce pic d’agrégation est suivi de la dégénérescence nigrostriatale ≈ 2-4 mois plus tard1,3,5. Ces stades pathologiques distincts fournissent aux chercheurs la plate-forme pour étudier et développer des stratégies qui 1) diminuent l’agrégation α-syn, 2) des inclusions α-syn déjà formées et/ou 3) empêchent la neurodégénérescence subséquente. Le modèle PFF offre des avantages et des inconvénients distincts par rapport aux modèles de surexpression α-syn à médiation virale, transgénique et neurotoxicant, tels que examinés précédemment6. Le choix du modèle ou de l’approche à adopter devrait être déterminé par le modèle qui convient le mieux à la question que les enquêteurs demandent.
Bien que le modèle de PFF ait été utilisé avec succès par de nombreux laboratoires, il existe encore des groupes qui ont connu des incohérences avec la production de fibrilles et la production d’une pathologie α-syn cohérente14. Des exemples d’incohérences vont des PFFs qui produisent peu ou pas de pathologie α-syn, l’efficacité de l’ensemencement par lots, et même l’échec des fibrilles à se former. Ainsi, la normalisation de la génération de PFF α-syn et de l’application in vivo est essentielle afin de permettre des interprétations exactes de l’impact des nouvelles interventions thérapeutiques. Le protocole suivant décrit les étapes requises pour la génération de PFFs à partir de monomères α-syn, le contrôle de qualité in vitro des PFFs une fois formés, la sonication et la mesure des PFFs avant l’utilisation, et des suggestions pour faciliter l’injection in vivo réussie de PFFs en rats ou en souris.
La production de PFFs α-syn capables d’ensemencer des neurones et conduisant à des inclusions de corps-like Lewy dépend de plusieurs facteurs et étapes. Un facteur essentiel est que les monomères utilisés pour produire des fibrilles doivent être formulés spécifiquement pour la fibrilisation4,9,14,15. Si les monomères ne sont pas formulés pour la fibrilisation, les fibrilles ne peuvent pas se former ou les fibrilles qui ne forment pas peuvent produire une pathologie α-syn. De même, le tampon que les monomères influencent également la fibrilisation. À ce titre, pour obtenir les meilleurs résultats, la concentration de sel doit être d’environ 100 mM de NaCl et de pH entre 7,0 et 7,3. Une première étape qui introduit la variabilité est la méthode par laquelle la teneur initiale en protéines est déterminée, avec une mesure à A280 susceptibles de produire des résultats plus précis et est donc la méthode préférée. L’écart dans la concentration de protéines peut diminuer l’efficacité du processus de fibrilisation, ainsi que modifier la concentration supposée de PFF utilisée dans les expériences. Les deux pourraient entraîner une diminution de l’efficacité des semis et de la variation des lots entre les expériences.
Les mesures initiales de contrôle de la qualité confirmeront les caractéristiques critiques des PFFS, en particulier qu’elles ont une conformation fibrillaire (microscopie électronique), contiennent des structures amyloïdes (dosage de la thioflavine T) et sont partir (dosage de la sédimentation). Il est important de noter que les résultats du dosage de la thioflavine T fluctueront avec le temps et ne sont pas une mesure directe de la quantité de structures amyloïdes présentes, plutôt, le dosage de la thioflavine T ne doit être utilisé que comme un indicateur de la présence de structures amyloïdes dans l’échantillon. La thioflavine T est généralement utilisée dans les essais in vitro, tels que le dosage susmentionné pour montrer que les fibrilles contiennent des structures amyloïdes. Alternativement, la thioflavine S est utilisée dans le tissu pour détecter les structures amyloïdes, comme le montre la figure 7. En ce qui concerne le dosage de la sédimentation, les résultats montrent seulement que les PFFS se trouvent principalement dans la fraction partir. Comme les échantillons sont exécutés dans des conditions de dénaturation, une seule bande proéminente d’environ 14 kDa, la taille des monomères α-syn, est présente sur les gels. C’est à la différence des bandes multiples présentes à des poids moléculaires plus élevés qui seraient attendus avec des PFFs si un gel natif ou non dénaturant a été utilisé. Enfin, la réussite de toutes ces étapes initiales de contrôle de la qualité ne garantit pas l’activité d’ensemencement de l’inclusion α-syn. Pour cette raison, des expériences de culture cellulaire ou une petite cohorte d’animaux injectés chirurgicalement devraient être utilisées pour tester l’efficacité des PFFs avant utilisation dans des expériences plus larges.
Sonication est une étape cruciale dans le processus et les paramètres différeront selon le modèle de sonicateur utilisé. Les paramètres de sonication doivent être appliqués et vérifiés pour montrer que des fragments de PFF courts ont été produits. La taille des fibrilles a un rapport avec l’ensemencement, avec des semis plus courts plus efficacement. Bien que les semences plus courtes fibrilles plus efficacement, cet effet plateaux et la longueur optimale PFF est d’environ 50 nm4,18. Il est également important de ne pas sur-sonicate les échantillons et exposer les PFFs à la chaleur excessive, car cela peut diminuer l’efficacité des semis. Ces PFFS soniqué doivent être testés pour l’efficacité dans la culture de petites cellules ou des expériences in vivo avant d’utiliser dans des expériences à plus grande échelle. Comme différentes séances de sonication ont le potentiel d’introduire la variabilité, les groupes de traitement expérimental devraient être planifiés en conséquence.
Lors de la livraison de PFFS in vivo, la localisation du ou des sites d’injection et la quantité totale de PFFS utilisés peuvent affecter le nombre de neurones qui développeront des inclusions ainsi que l’étendue de la neurodégénérescence7,14. Les coordonnées dans le protocole fournissent un endroit pour commencer, mais doivent être testées dans le laboratoire pour s’assurer que la région cible souhaitée développe la pathologie α-syn avant d’utiliser dans des expériences à grande échelle. Si désiré, le suivi de colorant ou de billes fluorescentes peut être utilisé comme un moyen de tester le ciblage régional avant d’utiliser des PFFs. La quantité de PFFS utilisé in vivo varie entre les groupes, la plupart des groupes utilisant un total compris entre 5 et 20 μg de PFFS à un ou divisé entre deux sites d’injection1,2,3,4,5 , le 6 , le 7 , 14. comme le nombre de sites d’injection, l’emplacement des sites d’injection, et la quantité de PFFS injectés peuvent affecter les résultats et la progression de la synucléinopathie, les résultats en aval des paramètres utilisés doivent être caractérisés avant d’utiliser le modèle pour tester les interventions potentielles ou examiner les caractéristiques temporelles du modèle.
Lors de la sélection d’un modèle à utiliser pour tester des thérapies ou étudier la progression de la maladie, le modèle utilisé doit être sélectionné pour répondre au mieux à la question posée. Tous les modèles ne posséderont pas certaines caractéristiques pathodynamiques de la maladie ou offriront le délai nécessaire pour tester les interventions potentielles. Le modèle de PFF récapitule les principales caractéristiques de la DP, telles que la pathologie α-syn et la neurodégénérescence, et peut conduire à des déficiences motrices modestes. Le modèle offre un temps-cours prévisible et prolongé, où les inclusions forment des mois avant la neurodégénérescence. Cela permet aux chercheurs d’examiner et d’exploiter les différentes phases tout au long de la progression prolongée de la synucléinopathie. L’utilisation actuelle et future du modèle global devrait être bénéfique dans l’étude de la progression de la maladie et du développement de nouvelles thérapies.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été soutenue par des subventions de la Fondation Michael J. Fox, de l’Institut national des troubles neurologiques et des AVC (NS099416) et du Weston Brain Institute.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |