הפרדת אפידרמיס ראט ודרמיס עם תרמוליסין לזיהוי mRNA וחלבון דלקתיים ספציפיים לאתר
Summary
מוצג כאן פרוטוקול להפרדת אפידרמיס מדרמיס להערכת ייצור מתווך דלקתי. בעקבות דלקת, אפידרמיס כף רגל אחורית חולדה מופרדת מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב 4 °C (50 °F). האפידרמיס משמש לאחר מכן לניתוח mRNA על ידי RT-PCR והערכה של חלבונים על ידי כתם מערבי ואימונוהיסטוכימיה.
Abstract
טכניקות קלות לשימוש וזולות נדרשות כדי לקבוע את הייצור הספציפי לאתר של מתווכים דלקתיים ונוירוטרופינים במהלך פגיעה בעור, דלקת ו/או רגישות. מטרת המחקר היא לתאר פרוטוקול הפרדה אפידרמלי-עורי באמצעות תרמוליסין, חלבון הפעיל ב 4 °C (70 °F). כדי להמחיש הליך זה, חולדות ספראג דולי הן מרדים, וכפות אחוריות ימניות מוזרקות לקרגינן. שש ו-12 שעות לאחר ההזרקה, חולדות עם דלקת וחולדות תמימות מורדמות, וחתיכת כף רגל אחורית, עור גלאברוי ממוקם במדיום הנשר המעודכן של דולבקו. האפידרמיס מופרד לאחר מכן בקרום המרתף מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב- PBS עם סידן כלורי. לאחר מכן, הדרמיס מאובטח על ידי מלקחיים זעירים, והאפידרמיס מתגרה בעדינות. כתמים כחולים טולואידין של קטעי רקמות מראים כי האפידרמיס מופרדת בצורה נקייה מן הדרמיס בקרום המרתף. כל שכבות תאי הקרטינוציט נשארות שלמות, ורכסי הרטי האפידרמלי יחד עם חריצים מפפילות עוריות נצפים בבירור. איכותי בזמן אמת RT-PCR משמש כדי לקבוע גורם גדילה עצבי ורמות ביטוי interleukin-6. סופג מערבי ואימונוהיסטוכימיה מבוצעים סוף סוף כדי לזהות כמויות של גורם גדילה עצבי. דו”ח זה ממחיש כי עיכול תרמוליצין קר היא שיטה יעילה להפריד אפידרמיס מדרמיס להערכת mRNA ושינויים בחלבון במהלך דלקת.
Introduction
הערכה של מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים מהעור יכולה להיות מוגבלת בשל ההטרוגניות של סוגי תאים שנמצאו בדמיס ואפידרמיס מודלקים1,2,3. מספר אנזימים, טכניקות כימיות, תרמיות או מכניות הכוללות הפרדה בין שתי השכבות או לביצוע דיסוציאציה של תאים להערכה נבדקו לאחרונה4. חומצה, אלקלי, מלח ניטרלי, וחום יכול להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס במהירות, אבל נפיחות תאית חוץ תאית מתרחשת לעתים קרובות5,6. טריפסין, לבלב, אלסטאז, קרטינאז, קולגנאז, פרונאז, דיספאז ותרמולצין הם אנזימים ששימשו להפרדה אפידרמלית-עורית4,7. טריפסין ואנזימים פרוטאוליטיים בקנה מידה רחב אחרים פעילים ב 37-40 °C (37 °F), אבל חייב להיות במעקב בקפידה כדי למנוע ניתוק של שכבות אפידרמיס. Dispase מבקע את האפידרמיס בדנסה לאמינה, אבל דורש 24 שעות להפרדה בקור4,8 או נקודות זמן קצרות יותר ב 37 °C4,9. תכונה מגבילה של כל הטכניקות האלה היא ההפרעה הפוטנציאלית של מורפולוגיה של רקמות ואובדן שלמות של mRNA וחלבון.
כדי לשמור על שלמות ה- mRNA והחלבון, יש לבצע שיטת הפרדת עור בקור לפרק זמן קצר. בהערכת טכניקות הפרדת העור למחקרי דלקת, thermolysin הוא אנזים יעיל להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס בטמפרטורות קרות4. תרמוליסין פעיל ב 4 °C (55 °F), מבקע את המידזמום האפידרמלי מן למינה לוסידה, ומפריד את האפידרמיס מן הדרמיס בתוך 1-3 שעות4,8,10. מטרת דו”ח זה היא לייעל את השימוש התרמוליסין להפרדת אפידרמיס חולדה מודלק מדרמיס כדי לזהות רמות mRNA וחלבון עבור מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים. מספר דו”חות ראשוניים הוצגו11,12,13,14,15. מטרת כתב יד זה היא לתאר טכניקה אופטימלית להפרדת העור באמצעות תרמוליסין ולהדגים את הזיהוי של 1) סמנים של דלקת, 2) אינטרלוקין-6 (IL-6) mRNA, ו -3) גורם גדילה עצבי (NGF) mRNA וחלבון באפידרמיס של חולדות עם דלקת הנגרמת על ידי קרגינן (C-II)16,17. דו”ח ראשוני באמצעות מודל אדג’ובנט מלא של פרוינד מציין כי NGF mRNA ורמות חלבון להגדיל מוקדם במהלך דלקת15. בעכברים, רגישות העור עם היישום אקטואלי של oxazolone גורם לעלייה מוקדמת IL-6 mRNA באמצעות הכלאה במקום36. IL-6 ו-NGF היו מעורבים ב-C-II18,19, אך לא היו דיווחים המתארים את רמות ה-MRNA או החלבון עבור IL-6 או NGF במיוחד מהאפידרמיס בשלבים החריפים של C-II.
טכניקת התרמוליסין זולה ופשוטה לביצוע. יתר על כן, הפרדת התרמוליסין של האפידרמיס מדרמיס מאפשרת mRNA, כתם מערבי, וניתוח אימונוהיסטוכימי של מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים במהלך תהליך של דלקת15. חוקרים צריכים להיות מסוגלים בקלות להשתמש בטכניקה זו הן במחקרים פרה קליניים והן במחקרים קליניים של דלקת בעור.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר קבע כי האפידרמיס של עור גלברוס כף רגל אחורית חולדה הופרד בקלות דרמיס באמצעות thermolysin (0.5 mG / mL) ב PBS עם 1 mM סידן כלורי ב 4 °C (2.5 שעות). הערכה היסתולוגית הצביעה על כך שהאפידרמיס הופרד מהדרמיס בקרום המרתף וכי רכסי הרט האפידרמליים היו שלמים. תרמוליסין הוא מטאלונדופפטידאאז חוץ-תאי המיוצר על ידי …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון למחקר זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
Referenzen
- Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
