Summary

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Published: August 27, 2019
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Summary

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Abstract

Mechanistische Erkenntnisse stammen aus einer sorgfältigen Untersuchung und Quantifizierung bestimmter RNAs und Proteine. Die relativen Positionen dieser Biomoleküle in der Zelle zu bestimmten Zeiten können mit Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) erfasst werden. Während einer lytischen Herpesvirus-Infektion entführt das Virus die Wirtszelle, um bevorzugt virale Gene auszudrücken, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und dem Verhalten von Biomolekülen führt. Lytische Aktivitäten konzentrieren sich auf Atomfabriken, die als Viralreplikationsfächer bezeichnet werden und nur mit FISH und IF erkennbar sind. Hier beschreiben wir ein anpassungsfähiges Protokoll von RNA FISH- und IF-Techniken für Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus-infizierte Zellen, sowohl anhaftend als auch in Suspension. Die Methode umfasst Schritte zur Entwicklung spezifischer Anti-Sense-Oligonukleotide, Doppel-RNA-FISH, RNA-FISH mit IF und quantitative Berechnungen von Fluoreszenzintensitäten. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf mehrere Zelltypen, nicht infizierte Zellen, latente Zellen, lytische Zellen, Zeitläufe und Zellen angewendet, die mit Inhibitoren behandelt wurden, um die räumlich-zeitlichen Aktivitäten bestimmter RNAs und Proteine sowohl vom menschlichen Wirt als auch von Proteinen aus dem menschlichen Wirt und KSHV.

Introduction

In ihrer lytischen (aktiven) Phase kapern Herpesviren die Wirtszelle, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und Lokalisierung biologischer Moleküle führt, um Virionen zu erzeugen. Die Operationsbasis ist der Kern, in dem das doppelsträngige DNA-Virusgenom repliziert undin eine Proteinhülle, Capsid 1, verpackt wird. Zu Beginn drückt das Virus seine eigenen Proteine aus, entführt Wirtsmaschinen und verhindert die Expression von nicht-essentiellen Wirtsgenen, ein Prozess, der als Wirtsabschalteffekt bezeichnet wird. Der Großteil dieser Aktivität ist lokalisiert auf spezifische 4-,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)-freie Kernregionen, die als Viralreplikationskompartimenten bezeichnet werden und aus Wirts- und Viralproteinen, RNAs und viraler DNA2bestehen. Die Zelle wird überholt, um Platz und Ressourcen für die Replikationsräume und damit die Montage von viralen Kapsiden bereitzustellen. Sobald das Capsid den Kern verlässt, ist unklar, wie das Capsid in das Zytoplasma eingehüllt wird, um ein membrangebundenes virales Teilchen zu produzieren, das auch als Virion bekannt ist. Das Verständnis der Lokalisierung und räumlichen Verschiebungen von Wirts- und viralen Biomolekülen während der lytischen Phase bietet tiefere mechanistische Einblicke in die Anordnung des Replikationsfachs, den Wirtsabschalteffekt, den Virion-Egress-Pfad und andere Prozesse im Zusammenhang mit herpesviralen Infektionen und Replikationen.

Derzeit ist die beste Methode, um diese Veränderungen zu erkennen und zu untersuchen, die Visualisierung von Proteinen und RNAs in infizierten Zellen mit Immunfluoreszenz (IF) bzw. fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (FISH). Die Verwendung eines Zeitverlaufs mit diesen Techniken zeigt die Lokalisierung von Biomolekülen an zentralen Punkten der lytischen Phase oder einfach, raumzeitliche Daten. FISH und IF ergänzen andere biochemische Techniken, wie z. B. Hemmung eines zellulären Prozesses (z. B. Hemmung der viralen DNA-Replikation), RT-qPCR (Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion), RNA-Sequenzierung, Nordflecken, Massenspektrometrie, Western Blotting und Analyse der viralen DNA-Produktion, die ein globaleres Bild der zellulären Aktivitäten liefern kann.

Wir entwickelten RNA-FISH-Strategien, um die RNA-Produkte aus bestimmten Genen zu untersuchen, und eine Rechneranalyse, die das nukleozytoplasmatische Verhältnis eines bestimmten Genprodukts quantitativ berechnet. Die Probenvorbereitung, modifiziert aus früheren Veröffentlichungen von Steitz und Kollegen3,4, ist relativ einfach und kann sowohl für Haftzellen als auch für suspendierte Zellen verwendet werden. Das Protokoll ist auch für den gleichzeitigen Einsatz mehrerer RNA FISH-Strategien (Double RNA FISH) oder RNA FISH mit IF-Strategien anpassungsfähig. Die Entwicklung einer spezifischen FISH-Strategie ist eine Herausforderung, aber es werden Vorschläge zur Verbesserung des Erfolgs skizziert. Die hier beschriebene Datenanalyse ist quantitativ, wenn fluoreszierende Perlen und starke Marker von Fachgrenzen verwendet werden und bietet zusätzliche Einblicke in die Mikrographen, Erkenntnisse, die Beobachtungsverzerrungen entfernen. Das detaillierte Protokoll ist sowohl für latente als auch für lytische Zellen konzipiert, die mit dem Mit dem Kaposi-Sarkat-assoziierten Herpesvirus (KSHV) infiziert sind, und kann mit nicht infizierten Zellen oder Zellen verwendet werden, die mit anderen Herpesviren infiziert sind5. Die Methoden der Quantifizierung sind auf Studien über nukleozytoplasmatische Verschiebungen oder Relokalisierung zwischen subzellulären Kompartimenten in den meisten Zellen anwendbar.

Protocol

1. Entwicklung von Fluoreszenz in situ (FISH) Anti-Sense-Oligonukleotide zum Nachweis einer spezifischen herpesviralen Transkription Wählen Sie 25 bis 40 nt Segmente aus der Sequenz der RNA von Interesse und konvertieren Sie, um Anti-Sinn zu sein. Eine erfolgreiche FISH-Strategie kann von einem bis zu zehn oder mehr verschiedenen Anti-Sense-Oligonukleotiden enthalten. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl von Sequenzen Folgendes: Wenn die RNA von Interesse einen einzigartigen Wiederholungsbereich enthä…

Representative Results

Die in diesem Manuskript beschriebenen FISH- und IF-Methoden sind in Abbildung 1 zusammen mit der Quantifizierung der Ergebnisse durch Linienspuren der fluoreszierenden Intensität dargestellt. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind semiquantitativ und bieten Einblicke in die Lokalisation und nicht in Vergleiche zwischen Intensitäten verschiedener fluoreszierender Flecken, da Experimente keine fluoreszierende Perle in die Diavorbereitung einbeziehen. <strong…

Discussion

Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll kann an verschiedene Zelltypen angepasst werden und enthält Schritte für doppel-RNA-FISH und RNA-FISH mit IF, wobei sowohl monoklonale als auch polyklonale Primärantikörper verwendet werden. Obwohl vorbereitete Dias in der Regel mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden, kann die Bildgebung mit einem STED-Mikroskop (stimulierte Emissionserschöpfung) nach Modifikationen der erhöhten Antikörperkonzentration und einem anderen Montagemedium durchgeführt werden. Zur …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski und Johanna B. Withers für die Beratung zur Datenanalyse. Wir danken auch G. Hayward für den Anti-SSB-Antikörper. Diese Arbeit wurde durch die Stipendien T32GM007223 und T32AI055403 von den National Institutes of Health (an TKV) und NIH Grant (CA16038) (an JAS) unterstützt. JAS ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute. Die Abbildungen 1-3 und Tabelle 1 wurden mit Genehmigung der American Society for Microbiology unter einer Creative Commons Attribution Lizenz der folgenden Publikation reproduziert: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi es Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Akkumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

Materials

AlexaFluor594-5-dUTP Life Technologies C1100
anti-DIG FITC  Jackson Lab Immunologicals 200-092-156
Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody Invitrogen A-11037 Goat
Anti-SSB Antibody N/A N/A Ref. Chiou et al. 2002
BLASTn NIH NCBI N/A Free Sequence Alignment Software
Dextran Sulfate Sigma Aldrich D8906 Molecular Biology Grade
DIG-Oligonucleotide Tailing Kit Sigma Roche #03353583910 2nd Gen
Eight-Chamber Slides Nunc Lab Tek II #154453 Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. 
Formamide Sigma Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
GAPDH Probes Stellaris SMF-2019-1 Compatible with protocol, Quasar 670
ImageJ  NIH, Bethesda, MD N/A Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzer IDT N/A Free Oligonucleotide Analyzer 
pcDNA3 Invitrogen A-150228
pmaxGFP Amaxa VDF-1012
Poly L-Lysine Sigma Aldrich P8920
Terminal Transferase Sigma Roche #003333574001
Vanadyl Ribonucleoside Complexes  NEB S1402S
Vectashield Vector Laboratories, Inc.  H-1000 DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. 

Referenzen

  1. Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  3. Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
  4. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
  5. Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
  6. Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  9. Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
  10. Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
  11. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  12. Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
  13. Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
  14. Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
  15. Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
  16. Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
  17. Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
  18. Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).

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Diesen Artikel zitieren
Vallery, T. K., Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (150), e59697, doi:10.3791/59697 (2019).

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