Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Nella loro fase litetica (attiva), gli herpesvirus dirottano la cellula ospite, causando cambiamenti nella morfologia cellulare e nella localizzazione delle molecole biologiche, per produrre virioni. La base delle operazioni è il nucleo, dove il genoma virale del DNA a doppio filamento viene replicato e confezionato in un guscio proteico, chiamato capside¹. Per cominciare, il virus esprime le proprie proteine, dirottando i macchinari ospiti e impedendo l’espressione di geni ospiti non essenziali, un processo chiamato effetto di chiusura dell’ospite. La maggior parte di questa attività è localizzata in specifiche regioni nucleari prive di 4,6-diamidino_2 -fenylindole (DAPI) chiamate compartimenti di replicazione virale, composti da proteine host e virali, RNA e DNA virale². La cella viene revisionata per fornire spazio e risorse per i compartimenti di replicazione e quindi l’assemblaggio di capsidi virali. Una volta che il capside esce dal nucleo, non è chiaro come il capside sia avvolto nel citoplasma per produrre una particella virale legata alla membrana, nota anche come virione. La comprensione della localizzazione e degli spostamenti spaziali delle biomolecole sia dell’ospite che di quella virale durante la fase littica fornisce una visione più profonda meccanistica della disposizione del compartimento di replicazione, dell’effetto di spegnimento dell’ospite, della via virione-uscita e di altri processi correlati all’infezione da herpesviral e alla replicazione.

Attualmente il metodo migliore per rilevare e studiare questi cambiamenti è la visualizzazione di proteine e RNA nelle cellule infette con immunofluorescenza (IF) e l’ibridazione fluorescente in situ (FISH), rispettivamente. L’uso di un corso temporale con queste tecniche rivela la localizzazione delle biomolecole nei punti chiave della fase littica o semplicemente, dati spatiotemporali. FISH e IF completano altre tecniche biochimiche, come l’inibizione di un processo cellulare (ad esempio, l’inibizione della replicazione del DNA virale), RT-qPCR (reazione a catena polimerasi in tempo reale), il sequenziamento dell’RNA, le macchie settentrionali, la spettrometria di massa, l’oscillazione occidentale e l’analisi della produzione di DNA virale, che può fornire un quadro più globale delle attività cellulari.

Abbiamo sviluppato strategie di RNA FISH per esaminare i prodotti dell’RNA da geni specifici e un’analisi computazionale che calcola quantitativamente il rapporto nucleocitoplasmatico di un prodotto genetico specifico. La preparazione di esempio, modificata da pubblicazioni precedenti da Steitz e colleghi^3,4, è relativamente semplice e può essere utilizzata sia per le cellule aderenti che per le cellule sospese. Il protocollo è anche adattabile per l’uso simultaneo di più strategie DI RNA FISH (double RNA FISH) o RNA FISH con strategie IF. Lo sviluppo di una strategia FISH specifica è impegnativo, ma vengono delineati suggerimenti per migliorare il successo. L’analisi dei dati qui descritta è quantitativa se vengono utilizzate perline fluorescenti e forti indicatori di confini di compartimenti e offre ulteriori informazioni sulle micrografie, informazioni che eliminano la distorsione di osservazione. Il protocollo dettagliato è progettato per cellule latenti e litine infettate dall’herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) e può essere utilizzato con cellule non infette o cellule infettate da altri herpesvirus⁵. I metodi di quantitazione sono applicabili agli studi sui spostamenti nucleocitoplasmatici o sulla rilocalizzazione tra compartimenti subcellulari nella maggior parte delle cellule.