여기서 우리는 성인, 수컷 위스타 래트에서 측면 유체 타악기 손상(FPI) 모델을 사용하여 심한 TBI를 유도하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 연속적인 비디오 EEG 기록을 수집하고 외상 후 간질 발생과 일치하는 간질 방전을 모니터링하기 위해 무선 원격 측정 시스템의 사용을 입증합니다.
측측액 타악기 상해 (FPI) 모형은 잘 설치되고 TBI 및 외상 후 간질 (PTE)를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 그러나, 상당한 가변성은 이 모형을 채택한 다른 연구 결과에서 사용된 특정 매개변수를 위해 보고되었습니다, 실험실 사이 결과를 조화하고 해석하는 것을 어렵게 만들기. 예를 들어, 가변성은 두개골 절제술의 크기와 위치, Luer 잠금 허브가 두개골 절제술에 비해 배치되는 방법, 경도에 가해지는 대기압 및 압력 펄스의 지속 기간에 대해 보고되었습니다. 이러한 각 매개 변수는 PTE발생률과 직접적인 상관관계가 있는 부상 심각도에 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 보고된 경련 성 포착의 반사 시간 및 부각을 바로 시키는, 사망률의 넓은 범위로 명시되었습니다. 여기에서 우리는 우리가 연구 사이 조화를 촉진하는 것을 돕기 위하여 이용된 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 무선 EEG 원격 측정 시스템과 함께 FPI를 사용하여 지속적으로 전기 학적 변화를 모니터링하고 발작 활동을 감지했습니다. FPI는 브레그마와 람다 사이, 왼쪽 반구에 5 mm 두개골 절제술을 생성하고 측면 능선에 인접하여 유도된다. 루어 잠금 허브는 두개골 절제술을 통해 두개골에 고정됩니다. 이 허브는 FPI 장치에 연결되며, 트위스트 록 커넥터를 통해 허브에 연결된 압력 튜브를 통해 20밀리초 압력 펄스가 손상되지 않은 듀라로 직접 전달됩니다. 회복 후, 쥐는 허브를 제거하기 위해 다시 마취된다. 5 개의 0.5 mm, 스테인레스 스틸 EEG 전극 나사는 두개골을 통해 듀라와 접촉하고 4 개의 기록 전극과 하나의 기준 전극역할을합니다. 전극 와이어는 뼈 시멘트와 장소에 고정 받침대 커넥터로 수집됩니다. 연속 비디오/EEG 녹화는 TBI 후 최대 4주 동안 수집됩니다.
2015년 의회에 제출한 보고서에서 질병통제센터는 연간 약 250만 명이 미국에서 외상성 뇌 손상(TBI)을 앓고 있다고 보고했습니다. TBI는 증상 간질의 20 %와 모든 간질의 5 %를 일으키는것으로 추정됩니다 2,3,4. 추가, TBI 환자의 대략 20%는 외상 후간질을 개발5. 중요한 것은, TBI의 결과로 발생하는 만성, 재발성 발작은 종종 약전성이 있으며, 질병의 부담을 증가시다6. 외상 후 간질 (PTE)로 이끌어 내는 정확한 기계장치는 불분명하게 남아 있습니다. 그러나, 몇몇 중요한 역학 연구 결과는 외상 후 간질 (PTE)개발의부각 그리고 잠재적인 리스크를 검토했습니다 2,4,7,8,9 ,10,11. 이 역학 연구는 각각 간질 발생의 리스크와 상해 엄격의 상관관계를 강화했습니다.
새로운 항 간질 치료를 확인하기 위하여 광범위하게 이용된 현재 방법은 간질을 유도하기 위하여 화학 경련제 또는 전기 불을 사용하는 모형에 무겁게 의존했습니다12. TBI 환자에 의해 이 모형에서 개발된 약에 약의 높은 부각을 감안할 때, 우리는 TBI 유도한 포착이 화학convulsant 또는 점화 유도한 포착과 다를 수 있고 다른 통로 또는 프로세스를 관련시킬 수 있다는 것을 가설합니다 간질 발생. 따라서, TBI 모델은 외상 후 간질 발생을 예방하는 데 더 효과적인 치료법의 개발에 더 적합할 수 있다.
TBI의 유체 타악기 손상 (FPI) 모델은 수십 년 동안 사용되어 왔으며 TBI 및 PTE13,14,15,16,17 을 모두 조사하는 잘 확립 된 방법입니다. 18. 그러나, 그러나, 우리가 최근에 검토한 바와 같이, 실험실19,20에걸쳐 보고된 FPI 방법에 있는 가변성의 높은 정도가 있습니다 . 실험실 사이 일관성의이 부족은 전임상 사실 인정의 재현성을 방지하고 결과의 해석을 도전하게 합니다. 그 결과, 이러한 유형의 연구에 대한 더 큰 조화를 수립하기위한 관심과 노력이 21,22,23,24로적용되었다.
외상 후 간질 발생을 연구하는 데 초점을 맞춘 실험실 간의 일관성과 조화를 더욱 높이기 위한 노력의 일환으로, 우리는 여기에 우리의 접근 방식에 대한 자세한 방법론을 제공합니다. 우리는 이전에 가혹한 TBI 20 후에 6 주 안에 경련성포착의 60% 부각을 보고했습니다. 우리는 지금 부상의 날을 시작하는 쥐를 감시하고 지속적으로 최대 4 주 동안 하루 24 시간을 따르기 위하여 이 접근을 이용합니다. 우리는 몇 가지 장점을 제공하는 무선 원격 분석 시스템을 사용하기로 결정했습니다. 첫째, 쥐는 케이지 를 자유롭게 움직일 수 있으므로 스트레스를 줄일 수 있습니다. 두 번째는 쥐가 지면역할을 함에 따라 신호 잡음의 감소. 또한, 우리의 현재 시스템은 세 비행기 (X, Y 및 Z)에서 빠른 움직임을 감지하고 경련 발작 이벤트를 식별하는 데 도움이 될 수있는 가속도계를 사용합니다. 마지막으로, 무선 원격 측정 시스템은 보조 식염수 주사와 같은 쥐의 관리를 쉽게 할 수 있습니다, 무게와 신경 심각도 점수를 실시, 쥐가 밧줄에 부착 될 때 복잡. 그러나 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 최대 8마리의 쥐를 동시에 기록하는 시스템의 초기 비용은 $60,000 범위에 있을 수 있습니다. 둘째, 전원은 배터리 소스에 의해 제한됩니다. 이를 위해서는 매일 배터리를 모니터링하고 교체해야 합니다. 배터리 교체 사이에 필요한 시간은 샘플링 속도에 따라 영향을 받을 수 있습니다. 그러나 1000Hz 샘플링 속도의 경우 배터리는 일반적으로 일주일에 한 번 변경됩니다. 제한된 전원 공급 장치는 또한 4개의 EEG 신호에서만 시스템을 기록하도록 제한합니다. 마지막으로 신호 드롭아웃은 제한적이지만 가끔 씩씩하게 발생합니다. 그러나, 이 접근법은 외상 후 간질 발생을 모니터링하는 일관되고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하고 새로운 치료 치료법의 식별에 도움을 수 있다.
FPI TBI 모델 14,26,27,28에사용되는 특정 파라미터 및 방법에 관한 실험실 간에 상당한 가변성이 보고되었다. 이러한 불일치는 결과가 충돌하고 실험실 간의 노력과 결과를 조화시키기 어렵게 만듭니다. 여기에서, 우리는 외상 후 간질 활동을 위해 감시하기 위하여 비디오/EEG의 장기, 연속적인 기록에 우리의 접근을 기술하는 상세한 방법론을 제시했습니다. 설명된 방법으로 재현 가능한 결과를 생성하는 데 는 여러 단계가 중요합니다.
첫째, 외상 후 간질의 발생률이 부상 심각도와 상관 관계가 있다는 점을 감안할 때, 가장 심각한 TBI를 초래하는 조건을 적용합니다. 특히, 5mm 의 두개골 절제술을 사용하여 충분히 넓은 경막 부위가 노출되도록하십시오. 또한, 두개골의 표면에 여성 – 여성 루어 잠금 장치를 고정, 개구부는 두개골 절제술 위에 직접 배치. 이것은 더 작은 craniectomy (3 mm) 및/또는 효과적으로 개구 크기를 감소시키는 두개골 안쪽에 수정한 바늘 허브를 두었던 그밖 실험실과 다릅니다. 루어 락을 크레니에절제술 외부에 배치하면 5mm 개구부가 유지됩니다. 이러한 특정 매개변수는 dura에 적용되는 전체 힘에 영향을 미칩니다. dura에 적용되는 대기압은 또한 관찰 된 부상의 심각도에 큰 영향을 미칩니다. 불행히도, 기압은 매우 가변적이며 장치에 의존하는 것으로 보입니다. 일부 실험실은 8 – 10 ms18의압력 펄스를 적용하는 것으로 보고되었습니다. 대조적으로, 여기에 설명된 방법은 20 ms 압력 펄스를 초래한다. 이것은 더 심각한 부상을 생성하는 것으로 보이는 다른 실험실과 일치14, 28. 상해를 유발하는 압력 펄스는 실험실 간에 상당한 가변성을 보이는 매개 변수이며 경험적으로 정의되어야 합니다. 그러나, 상해 중증도는 사망률(40-50%), 권리 반사 시간(>30 분)26의조합에 기초하여 결정될 수 있다. 또한 손상되지 않은 경도를 가진 동물만 연구에 포함되는 것이 중요합니다. 또한, 두개골 절제술이 크레니크 절제술 아래 의 경막 일부가 유체 압력 펄스의 전체 힘에 노출되지 않도록 접착제 또는 시멘트에 의해 가려지면 동물은 연구에서 제거해야합니다. 또한 Luer 잠금 장치 아래에 있는 과도한 접착제는 내구성을 부착하고 성공적인 부상 후에도 시멘트 캡으로 제거할 수 있습니다. 마지막으로, 오실로스코프 트레이스에서 압력 펄스 곡선의 매끄러운 형상은 유체 챔버에 기포가 없다는 표시를 제공하고 플런저가 임피던스 없이 움직이고 있음을 나타냅니다.
마취는 통제되어야 하는 또 다른 중요한 요소입니다. Isoflurane 노출은 마취의 외과 비행기를 유지하기 위하여 가능한 가장 낮은 수준으로 유지되어야 합니다. 이소플루란의 상부에 드러내거나 장기간 에 노출된 쥐는 신경발생유발 폐부종을 개발할 가능성이 더 높습니다. 두개골의 준비는 방법의 또 다른 중요한 측면을 나타냅니다. 특히, 두개골을 건조하고 뼈 먼지를 제거하는 것은 쥐가 송신기를 조기에 제거하는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.
나사의 배치와 EEG 와이어의 연결은 일관되게 재현 가능한 레코딩을 생성하는 데 매우 중요합니다. 나사는 뇌의 병변을 유발하기 위해 너무 깊이 배치되지 않는 것이 중요합니다. 성인(12주 령)의 두개골 절제술로부터 회수된 뼈 플랩은 일관되게 2 mm 두께이다. 2.5mm 샤프트가 있는 EEG 전극 나사를 사용합니다. 구부러진 모기 지혈 집게의 팁을 스페이서로 사용하여 나사가 뼈의 기저부로만 확장되고 뇌로 돌출되지 않도록하는 것이 좋습니다.
여기에 제시된 접근 방식에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 배터리는 정기적으로 교체해야 합니다. 배터리 교체 빈도는 샘플링 속도에 따라 다릅니다. 배터리는 일반적으로 1000Hz의 샘플링 속도에 대해 일주일에 한 번 변경됩니다. 이 시간 프레임은 샘플링 속도를 줄임으로써 연장될 수 있습니다. 이 시스템은 또한 4개의 모노폴라 EEG 전극으로부터의 기록으로 제한된다. 그러나, 이것은 반구 당 2개의 채널을 제공하고 초점과 일반화한 사건 사이에서 구별할 수 있고 전방과 후방 변경을 구별할 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구하고, 이러한 접근법은 심각한 TBI에 이어 간질 변화의 지속적인 비디오/EEG 모니터링 및 검출을 수행하는 합리적인 방법을 제공한다.
여기에서 기술된 방법은 TBI 다음 1 달 안에 전기질과 경련성 포착 둘 다 귀착됩니다. 따라서, 이러한 접근법은 심각한 TBI에 이어 간질 발생을 예방하기 위한 잠재적 치료제를 연구하는 합리적인 시간 프레임을 제공한다. 이 접근법은 또한 PTE와 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 방법을 제공하고 PTE 발병 위험이 가장 높은 환자를 식별하는 데 사용될 수 있는 잠재적인 바이오마커의 식별을 유도할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그래픽 디자인과 인물의 준비에 그의 귀중한 지원에 대한 폴 드레셀에게 감사드립니다.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |