ここでは、成人、オスのウィスターラットにおける横液パーカッション傷害(FPI)モデルを有する重篤なTBIを誘導するプロトコルを提示する。また、ワイヤレステレメトリシステムを使用して、連続的なビデオEEG記録を収集し、外傷後てんかん形成と一致するてんかんの排出を監視する方法も示しています。
横液パーカッション傷害(FPI)モデルは十分に確立され、TBIおよび外傷後てんかん(PTE)の研究に使用されている。しかし、このモデルを採用した異なる研究で使用される特定のパラメータに対してかなりの変動性が報告されており、実験室間での結果の調和と解釈が困難です。例えば、頭蓋切除術の大きさと位置、ルアーロックハブが頭蓋切除術に対してどのように配置されるかについて、硬膜に加える大気圧および圧力パルスの持続時間に関する変動性が報告されている。これらのパラメータのそれぞれは、PTEの発生率と直接相関する傷害の重症度に影響を与える可能性があります。これは、死亡率の広い範囲として明らかにされています, 右反射時間と報告された痙攣発作の発生.ここでは、研究間の調和を促進するために使用した方法の詳細なプロトコルを提供します。FPIを無線EEGテレメトリシステムと組み合わせて、電極の変化を継続的に監視し、発作活動を検出しました。 FPIは、ブレグマとラムダの間、および横尾根に隣接する左半球上に5mmの頭蓋切除術を作成することによって誘導される。ルアーロックハブは頭蓋切除術の頭蓋骨に固定されています。このハブはFPIデバイスに接続され、20ミリ秒の圧力パルスは、ツイストロックコネクタを介してハブに接続された圧力チューブを介して無傷のデュラに直接送達されます。回復後、ラットはハブを取り除くために再麻酔される。5つの0.5 mm、ステンレス鋼のEEGの電極ねじは頭蓋骨を通して硬膜と接触して置かれ、4つの記録電極および1つの参照電極として役立つ。電極ワイヤーは骨セメントとの場所に固定される台座のコネクターに集まる。連続ビデオ/脳波録画は、TBI後最大4週間収集されます。
2015年の議会への報告書では、米国疾病対策センターは、米国1で年間約250万人が外傷性脳損傷(TBI)に罹患していると報告している。TBIは、全てんかんの20%、全てんかんの5%を引き起こすと推定されています2,3,4 .さらに、TBI患者の約20%が外傷後てんかん5を発症する。重要なことに、TBIの結果として起こる慢性、再発性発作は、しばしば薬剤耐性であり、疾患6の負担を増加させる。外傷後てんかん(PTE)につながる正確なメカニズムは不明のままである。しかし、いくつかの主要な疫学研究は、外傷後てんかん(PTE)2、4、7、8、9を発症する発生率と潜在的なリスクを調べました、10、11.これらの疫学研究は、それぞれてんかん形成のリスクと傷害重症度の相関を強化した。
新しい抗てんかん療法を同定するために広く使用されている現在の方法は、てんかんを誘発するために化学痙攣薬または電気的キンドリングを使用するモデルに大きく依存している12。TBI患者がこれらのモデルで開発した薬物に対する薬物耐性の高い発生率を考えると、我々は、TBI誘発性発作が化学腫瘍または薬物誘発性発作とは異なり、異なる経路またはプロセスを伴う可能性があると仮定する。てんかん形成。したがって、TBIモデルは、外傷後てんかん形成を防ぐためにより効果的な治療法の開発に適している可能性があります。
TBIの流体パーカッション傷害(FPI)モデルは何十年も使用されており、TBIとPTE 13、14、15、16、17の両方を調査するための確立された方法です。18.しかし、我々は最近レビューしたように、実験室19、20全体で報告されたFPI法の変動度が高い。この実験室間の一貫性の欠如は、前臨床所見の再現性を妨げ、結果の解釈を困難にする。その結果、これらの研究21、22、23、24の研究のためのより大きな調和の確立に向けて、関心と努力が高まっています。
外傷後てんかん形成の研究に焦点を当てた研究室間の一貫性と調和をさらに高めるために、我々のアプローチの詳細な方法論をここで提供する。我々は以前に重度のTBI20の後6週間以内に痙攣発作の60%の発生率を報告した。私たちは今、このアプローチを使用して、傷害の日を始めるラットを監視し、継続的に4週間まで24時間彼らに従います。私たちは、いくつかの利点を与える無線テレメトリシステムを使用することを選択しました。まず、ラットはケージの中を自由に動き回ることができるので、ストレスを軽減します。第二に、ラットが地面として機能するように信号ノイズの低減。さらに、現在のシステムは、3つの平面(X、Y、Z)すべてで急速な動きを検出する加速度計を採用しており、痙攣発作を特定するのに役立ちます。最後に、無線テレメトリシステムは、ラットがテザーに取り付けられているときに複雑である、補足生理生理生理生理的注射、計量および実施神経重症度スコアなどのラットの管理を容易にします。ただし、この方法にはいくつかの制限もあります。まず、最大8匹のラットを同時に記録するシステムの初期コストは、60,000ドルの範囲にすることができます。第二に、電力はバッテリソースによって制限されます。これには、毎日の監視と電池の交換が必要です。バッテリの変更に必要な時間は、サンプリング レートの影響を受ける可能性があります。ただし、1000 Hz のサンプリング レートの場合、通常、バッテリは週に 1 回交換されます。限られた電源はまた4つのEEG信号からの記録にシステムを制限する。最後に、信号のドロップアウトは制限されますが、時折発生します。しかし、このアプローチは、外傷後てんかんを監視するための一貫した信頼性の高い方法を提供し、新しい治療治療の同定に役立てることができます。
FPITBIモデル14、26、27、28に使用される特定のパラメータと方法に関する実験室間でかなりの変動が報告されている。これらの不整合により、結果が競合し、ラボ間の作業と結果の調和が困難になっています。ここでは、外傷後てんかん活性を監視するためのビデオ/EEGの長期連続記録に対する我々のアプローチを説明する詳細な方法論を提示した。説明した方法で再現可能な結果を生成するには、多くの手順が重要です。
まず、外傷後てんかんの発生率が傷害重症度と相関することを考えると、最も重篤なTBIをもたらす条件を適用する。具体的には、5 mm 頭蓋切除術を使用して、十分に広い面積の硬膜が露出していることを確認します。さらに、頭蓋骨の表面に女性-女性のLuerロック装置を固定し、開口部は頭蓋切除術の上に直接置かれる。これは、より小さい頭蓋切除術(3 mm)を使用した他の実験室とは異なり、または針ハブを頭蓋切除術の中に置き、開口部のサイズを効果的に小さくします。頭蓋切除術の外側にLuerロックを置くことによって、5mmの開口部は維持される。これらの特定のパラメータは、dura に適用される全体的な力に影響します。硬膜に加える大気圧はまた、観察された傷害の重症度に大きな影響を与える。残念ながら、大気圧は非常に変動し、デバイスに依存しているように見えます。いくつかのラボは、8 – 10ミリ秒18の圧力パルスを適用すると報告しています.これに関して、ここで説明する方法は、20ミリ秒の圧力パルスをもたらす。これは、より重度の傷害を生成するように見える他のラボと一致しています14,28.損傷誘発圧力パルスは、ラボ間のかなりの変動性を示すパラメータであり、経験的に定義されなければならないことは明らかです。しかし、傷害の重症度は、死亡率(40〜50%)、右反射時間(>30分)26の組み合わせに基づいて決定され得る。また、無傷のデュラを持つ動物だけが研究に含まれることも重要です。さらに、頭蓋切除術が頭蓋切除術の下の硬膜の一部が流体圧力パルスの完全な力にさらされないように、頭蓋切除術が任意の接着剤またはセメントによって閉塞されている場合、動物は研究から排除されるべきである。 また、Luerロックの下の余分な接着剤は、デュラに付着し、成功した傷害の後でもセメントキャップでそれを取り除くことができます。 最後に、オシロスコープトレース上の圧力パルス曲線の滑らかな形状は、流体チャンバに気泡がないことを示し、プランジャーがインピーダンスなしで動いていることを示します。
麻酔は、制御しなければならないもう一つの重要な要因です。イソファラン暴露は、麻酔の外科面を維持するために可能な限り低いレベルに保たれるべきである。イソルランの高いレベルまたは長期間のラットは、神経原性誘発性肺水腫を発症する可能性が高い。頭蓋骨の調製は、方法の別の重要な側面を表す。特に、頭蓋骨を乾燥させ、骨のほこりを取り除くことは、ラットが送信機を早期に取り外すことを防ぐのに役立ちます。
ネジの配置とEEGワイヤの接続は、一貫して再現可能な記録を生成するために明らかに重要です。ネジは、脳に病変を誘発するように深く配置されていないことが重要です。成人(12週齢)の頭蓋切除術から回復した骨フラップは、一貫して2mmの厚さである。2.5 mm シャフト付きの EEG 電極ネジを使用します。曲がった蚊の止血鉗子の先端をスペーサーとして使用して、ネジが骨の底部まで伸び、脳に突き出ないようにすることが役立ちます。
ここで説明する方法にはいくつかの制限があります。電池は定期的に交換する必要があります。バッテリの変更頻度は、サンプリングレートによって異なります。通常、バッテリは 1000 Hz のサンプリング レートで週に 1 回交換されます。この時間枠は、サンプリングレートを減らすことによって拡張することができます。システムはまた4つの単極EEG電極からの記録に限られる。ただし、これは半球ごとに 2 つのチャネルを提供し、焦点イベントと一般化されたイベントを区別し、前部と後部の変化を区別できます。これらの制限にもかかわらず、このアプローチは、重度のTBIに続くてんかんの変化の連続的なビデオ/脳波モニタリングおよび検出を行うための合理的な方法を提供する。
ここで説明する方法は、TBI後1ヶ月以内に電機および痙攣発作の両方をもたらす。したがって、このアプローチは、重度のTBIに続くてんかん形成を予防するための潜在的な治療法を研究する合理的な時間枠を提供する。このアプローチはまた、PTEに関連する分子メカニズムを調査する方法を提供し、PTEを発症するリスクが最も高い患者を特定するために使用できる潜在的なバイオマーカーの同定につながる可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、グラフィカルなデザインとフィギュアの準備における彼の貴重なサポートのためにポール・ドレッセルに感謝したいと思います。
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |