هنا نقدم بروتوكولا للحث على TBI شديدة مع نموذج إصابة قرع السوائل الجانبية (FPI) في الكبار، والفئران ويستار الذكور. كما نبين استخدام نظام القياس عن بعد اللاسلكي لجمع تسجيلات الفيديو وEEG المستمرة ورصد الإفرازات epileptiform بما يتفق مع تكوين الصرع بعد الصدمة.
نموذج إصابة قرع السوائل الجانبية (FPI) راسخ وقد تم استخدامه لدراسة TBI والصرع اللاحق للصدمة (PTE). ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن تباين كبير في البارامترات المحددة المستخدمة في مختلف الدراسات التي استخدمت هذا النموذج، مما يجعل من الصعب تنسيق وتفسير النتائج بين المختبرات. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن التباين فيما يتعلق بحجم وموقع فغر الجمجمة، وكيف يتم وضع محور قفل Luer بالنسبة إلى فغر القحف، والضغط الجوي المطبق على الدورة ومدة نبض الضغط. كل من هذه المعلمات يمكن أن تؤثر على شدة الإصابة، والتي ترتبط مباشرة مع حدوث PTE. وقد تجلى ذلك في مجموعة واسعة من معدلات الوفيات، وتصحيح الفترات المنعكسة، وحدوث النوبات المتشنجة المبلغ عنها. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا للأسلوب الذي استخدمناه للمساعدة في تيسير المواءمة بين الدراسات. استخدمنا FPI في تركيبة مع نظام القياس عن بعد تخطيط كهربية الدماغ اللاسلكية لمراقبة باستمرار للتغيرات الكهربائية والكشف عن نشاط المضبوطات. ويتسبب في ذلك فبهيا عن طريق خلق استئصال القحف 5 ملم فوق نصف الكرة الأيسر، بين بريغما ولامدا والمتاخمة للحافة الجانبية. يتم تأمين محور قفل Luer على الجمجمة فوق فغر الجمجمة. يتم توصيل هذا المحور بجهاز FPI، ويتم توصيل نبض الضغط 20 مللي ثانية مباشرة إلى الدورة سليمة من خلال أنابيب الضغط المتصلة بالمحور عن طريق موصل قفل تويست. بعد الشفاء، يتم إعادة التخدير الفئران لإزالة المحور. خمسة 0.5 ملم، يتم وضع مسامير الكهربائي EEG الفولاذ المقاوم للصدأ في اتصال مع دورا من خلال الجمجمة، وتعمل كأربعة أقطاب تسجيل والقطب المرجعي واحد. يتم جمع أسلاك القطب الكهربائي في موصل قاعدة التمثال التي يتم تأمينها في مكانها مع الاسمنت العظام. يتم جمع تسجيلات الفيديو/تخطيط كهربية الدماغ المستمرة لمدة تصل إلى 4 أسابيع بعد TBI.
في تقرير عام 2015 إلى الكونغرس، ذكرت مراكز السيطرة على الأمراض أن ما يقرب من 2.5 مليون شخص سنويا يعانون من إصابات الدماغ الصادمة (TBI) في الولايات المتحدة1. ويقدر أن TBI يسبب 20٪ من أعراض الصرع و 5٪من جميع الصرع 2،3،4. وبالإضافة إلى ذلك، حوالي 20% من مرضى TBI تطوير الصرع ما بعد الصدمة5. الأهم من ذلك، المضبوطات المزمنة المتكررة التي تحدث نتيجة لTBI غالبا ما تكون مقاومة للأدوية، مما يزيد من عبء المرض6. ولا تزال الآليات الدقيقة التي تؤدي إلى الصرع اللاحق للصدمة غير واضحة. ومع ذلك، فقد درست العديد من الدراسات الوبائية الرئيسية حدوث وخطر الإصابة المحتملة للصرع التالي للصدمة (PTE)2،4،7،8،9 10,11. وقد عززت هذه الدراسات الوبائية من ارتباط شدة الإصابة بخطر تكوين الصرع.
وقد اعتمدت الأساليب الحالية التي استخدمت على نطاق واسع لتحديد العلاجات المضادة للصرع الجديدة اعتمادا كبيرا على النماذج التي تستخدم التشنجات الكيميائية أو الإثارة الكهربائية للحث على الصرع12. نظراً لارتفاع معدل مقاومة الأدوية للأدوية التي تم تطويرها في هذه النماذج من قبل مرضى TBI، فإننا نفترض أن النوبات الناجمة عن TBI قد تكون مختلفة عن التشنجات الكيميائية أو النوبات الناجمة عن التسبب في التسبب في الإصابة بها، وقد تنطوي على مسارات أو عمليات مختلفة الصرع. ولذلك، قد يكون نموذج TBI أكثر ملاءمة لتطوير العلاجات التي هي أكثر فعالية لمنع تكوين الصرع بعد الصدمة.
وقد استخدم نموذج إصابة قرع السوائل (FPI) من TBI لعقود وهو طريقة راسخة للتحقيق في كل من TBI و PTE13،14،15،16،17، 18. ومع ذلك، وكما استعرضنا مؤخرا، هناك درجة عالية من التباين في طرق FPI المبلغ عنها عبر المختبرات19،20. وهذا الافتقار إلى الاتساق بين المختبرات يحول دون استنساخ النتائج السابقة للإكلينيكية ويجعل تفسير النتائج تحدياً. ونتيجة لذلك، تم تطبيق اهتمام وجهود متزايدة من أجل تحقيق مزيد من المواءمة لهذه الأنواع من الدراسات21،22،23،24.
في محاولة لزيادة الاتساق والمواءمة بين المختبرات التي تركز على دراسة تكوين الصرع بعد الصدمة، ونحن نقدم هنا منهجية مفصلة لنهجنا. وقد سبق لنا أن أبلغنا عن حدوث 60٪ من النوبات المتشنجة في غضون ستة أسابيع بعد TBI شديدة20. نحن الآن استخدام هذا النهج لرصد الفئران بدءا من يوم الإصابة وباستمرار متابعتها 24 ساعة في اليوم لمدة تصل إلى 4 أسابيع. لقد اخترنا استخدام نظام القياس عن بعد اللاسلكية التي توفر العديد من المزايا. أولا، الفئران قادرة على التحرك بحرية حول قفصهم، وبالتالي يقلل من الإجهاد. ثانيا انخفاض في الضوضاء إشارة كما يعمل الفئران كالأرض. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم نظامنا الحالي مقياس التسارع الذي يكشف الحركة السريعة في جميع الطائرات الثلاث (X، Y و Z) ويمكن أن يكون مفيدا لتحديد أحداث النوبات المتشنجة. وأخيراً، يسمح نظام القياس عن بعد اللاسلكي بإدارة أسهل للفئران مثل الحقن المالحة التكميلية، ووزن وإجراء درجات شدة عصبية، وهو أمر معقد عندما يتم ربط الجرذان بحبل. غير أن هذا النهج ينطوي أيضا ً على عدة قيود. أولا، يمكن أن تكون التكلفة الأولية لنظام لتسجيل ما يصل إلى ثمانية فئران في وقت واحد في حدود 60,000 دولار. ثانياً، الطاقة محدودة من قبل مصدر البطارية. وهذا يتطلب رصداً يومياً واستبدال البطاريات. يمكن أن يتأثر الوقت المطلوب بين تغيرات البطارية بمعدل أخذ العينات. ومع ذلك، بالنسبة لمعدل أخذ العينات 1000 هرتز، يتم تغيير البطاريات عادة مرة واحدة في الأسبوع. كما أن إمدادات الطاقة المحدودة تقيد النظام بالتسجيل من أربع إشارات تخطيط كهربية الدماغ فقط. وأخيراً، فإن تسرب الإشارة محدود ولكنه يحدث في بعض الأحيان. ومع ذلك، يوفر هذا النهج طريقة متسقة وموثوقبها لرصد تكوين الصرع بعد الصدمة ويمكن أن يساعد في تحديد العلاجات العلاجية الجديدة.
وقد تم الإبلاغ عن تباين كبير بين المختبرات فيما يتعلق بالبارامترات والأساليب المحددة المستخدمة في نموذج FPI TBI 14و26و27و28 . وقد أدت هذه التناقضات إلى نتائج متضاربة وتجعل من الصعب مواءمة الجهود والنتائج بين المختبرات. هنا، قدمنا منهجية مفصلة تصف نهجنا في التسجيل الطويل الأجل والمستمر للفيديو/تخطيط الدماغ لرصد نشاط epileptiform التالي للصدمة. عدد من الخطوات حاسمة لإنشاء نتائج قابلة للتكرار مع الأسلوب الموصوف.
أولاً، نظراً لأن حدوث الصرع التالي للصدمة يرتبط بخطورة الإصابة، تطبيق الظروف التي تؤدي إلى الإصابة بالإصابة بإصابات شديدة. على وجه التحديد، استخدم عملية استئصال القحف 5 مم لضمان تعرض مساحة كبيرة بما فيه الكفاية من الدورة. وبالإضافة إلى ذلك، تأمين جهاز قفل Luer الإناث على سطح الجمجمة، مع فتح وضعت مباشرة على فغر الجمجمة. هذا يختلف عن المختبرات الأخرى التي استخدمت أصغر فرق (3 مم) و / أو وضع محور إبرة معدلة داخل فرق, مما يقلل بشكل فعال من حجم الافتتاح. من خلال وضع قفل Luer خارج عملية استئصال القحف، يتم الحفاظ على فتحة 5MM. تؤثر هذه المعلمات المحددة على القوة الإجمالية المطبقة على الدورة. الضغط الجوي المطبق على الدورة يكون له أيضا تأثير كبير على شدة الإصابات التي لوحظت. لسوء الحظ، الضغط الجوي متغير للغاية ويبدو أن الجهاز تعتمد. وقد ذكرت بعض المختبرات تطبيق نبض ضغط من 8 -10 مللي ثانية18. وعلى النقيض من ذلك، فإن الطريقة الموصوفة هنا تؤدي إلى نبض ضغط 20 مللي ثانية. وهذا يتسق مع مختبرات أخرى التي يبدو أن تولد إصابة أكثر شدة 14,28. ومن الواضح أن نبض الضغط المسبب للإصابة هو معلمة تظهر تبايناً كبيراً بين المختبرات ويجب تعريفها تجريبياً. ومع ذلك، يمكن تحديد شدة الإصابة على أساس مزيج من معدلات الوفيات (40-50%)، وتصحيح أوقات الانعكاس (> 30 دقيقة)26. ومن الأهمية بمكان أيضا أن يتم تضمين الحيوانات فقط مع دورا سليمة في الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان استئصال القحف قد أُكبَّ من قبل أي غراء أو أسمنت ٍ ّ بحيث لا يتعرض جزء من القَورة تحت القحف للقوة الكاملة لنبض ضغط السائل، فيجب أن يُزال الحيوان من الدراسة. أيضا، الغراء الزائد تحت قفل Luer يمكن التمسك دورا وإزالتها مع غطاء الاسمنت حتى بعد إصابة ناجحة. وأخيرا، فإن الشكل السلس لمنحنى نبض الضغط على تتبع الذبذبات يعطي مؤشرا على أنه لا توجد فقاعات الهواء في غرفة السوائل ويشير إلى المكبس يتحرك دون مقاومة.
التخدير هو عامل حاسم آخر يجب السيطرة عليه. يجب أن يبقى التعرض الايسوفلوران إلى أدنى مستويات ممكنة للحفاظ على مستوى جراحي من التخدير. الجرذان المعرضة لمستويات أعلى من الايسوفلوران أو لفترات طويلة هي أكثر عرضة لتطوير وذمة رئوية الناجمة عن العصبية. إعداد الجمجمة يمثل جانبا حاسما آخر من هذه الطريقة. على وجه الخصوص، تجفيف الجمجمة وإزالة أي غبار العظام يساعد على منع الفئران من إزالة جهاز الإرسال قبل الأوان.
ومن الواضح أن وضع مسامير وتوصيل أسلاك تخطيط الدماغ أمر حاسم لإنتاج تسجيلات قابلة للتكرار باستمرار. من المهم أن لا يتم وضع مسامير عميق جدا كما للحث على آفة في الدماغ. رفرف العظام تعافى من استئصال القحف من الكبار (12 أسابيع من العمر) الفئران ويستار الذكور هو باستمرار 2 مم سميكة. استخدام مسامير الكهربائي EEG مع رمح 2.5 مم. من المفيد استخدام أطراف ملقط البعوض الهيموستاتيكي المنحني كفاصل لضمان أن البراغي تمتد فقط إلى قاعدة العظام ولا تبرز في الدماغ.
والنهج المعروض هنا له بعض القيود. يجب تغيير البطاريات على أساس منتظم. يعتمد تواتر التغيرات في البطارية على معدل أخذ العينات. وعادة ما تتغير البطاريات مرة واحدة في الأسبوع لمعدل أخذ العينات من 1000 هرتز. ويمكن تمديد هذا الإطار الزمني عن طريق خفض معدل أخذ العينات. ويقتصر النظام أيضا على التسجيل من أربعة أقطاب كهربائية كهربائية احتكارية. ومع ذلك، فإن هذا يوفر قناتين لكل نصف الكرة الأرضية ويمكن أن يميز بين الأحداث البؤرية والأحداث المعممة ويمكن أن يميز بين التغيرات الأمامية والخلفية. وعلى الرغم من هذه القيود، يوفر هذا النهج طريقة معقولة لإجراء رصد مستمر للفيديو/تخطيط الدماغ والكشف عن التغيرات في شكل epileptiform بعد حدوث إصابات حادة.
الطريقة الموصوفة هنا ينتج عنها النوبات الإلكتروجرافية والتشنجية في غضون شهر واحد بعد TBI. ولذلك، يوفر هذا النهج إطارا زمنيا معقولا لدراسة العلاجات المحتملة للوقاية من تكوين الصرع بعد مرض التميّز الحاد. ويوفر هذا النهج أيضا طريقة للتحقيق في الآليات الجزيئية المرتبطة PTE ويمكن أن يؤدي إلى تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة التي يمكن استخدامها لتحديد المرضى الذين هم الأكثر عرضة لخطر تطوير PTE.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر بول دريسل على دعمه القيم في تصميم الرسوم البيانية وإعداد الأرقام.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |