Summary

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

Published: June 19, 2019
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Summary

여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.

Abstract

이 문서에서는, 우리는 전체 BM CyTOF 분석을 위한 신선한 BM에 있는 호중구 계보 세포를 보존하기 위하여 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 골수성 편향 된 39 항체 CyTOF 패널을 사용하여이 프로토콜을 사용하여 호중구 혈통 세포에 초점을 맞춘 조혈 시스템을 평가했습니다. CyTOF 결과는 오픈 리소스 차원 감소 알고리즘, viSNE로 분석되었고, 데이터는 이 프로토콜의 결과를 입증하기 위해 제시되었다. 우리는 이 프로토콜에 근거를 둔 새로운 호중구 혈통 세포 인구를 발견했습니다. 신선한 전체 BM 제제의 이 프로토콜은 1), 전체 BM에서 확인되지 않은 세포 집단을 발견하기 위해 CyTOF 분석을 위해 사용될 수 있습니다, 2), 백혈병과 같은 혈액 장애를 가진 환자를 위한 전체 BM 결점을 조사하는, 3), 의 최적화를 지원 신선한 전체 BM을 활용하는 형광 활성화 유동 세포 분석 프로토콜.

Introduction

지난 수십 년 동안, 세포 분석 방법은 BM의 조혈 시스템을 조사하는 강력한 도구되었습니다. 이러한 방법은 중금속 표지 항체를 사용하여 형광 활성화 유동 세포 분석 및 CyTOF의 새로운 방법을 포함한다. 그(것)들은 그들의 유일한 표면 마커 발현 단면도의 확인에 의하여 이기종 생물학 견본에 있는 많은 세포 모형의 발견으로 이끌어 냈습니다. 더 많은 채널과 관련된 스펙트럼 중복이 증가하면 형광 활성화 유동 세포 분석 애플리케이션에서 더 높은 데이터 부정확성이 발생합니다. 따라서, 불순한 세포는 형광 활성화 유동 세포 분석 분석을 위한 관심있는 세포 인구를 풍부하게 하기 위하여 일상적으로 제거됩니다. 예를 들어, Ly6G (또는 Gr-1) 및 CD11b는 성숙한 골수성 세포 마커로 간주되며 Ly6G+ (또는 Gr-1+) 및 CD11b+ 세포는 유세포 분석 전에 자기 농축 키트를 사용하여 BM 샘플에서 일상적으로 제거됩니다. 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 또는 하나의 덤프 칵테일 채널 1,2,3에이러한 마커를 결합하여. 또 다른 예는 호중구가 면역학 연구를 위한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 풍부하게 하기 위하여 인간적인 혈액 견본에서 일상적으로 제거된다는 것입니다. 마우스 또는 인간에서 격리된 전체 골수는, 그러나, 세포 측정 분석을 위해 손상되지 않는 조사되지 않습니다.

최근 CyTOF는 조혈 계 4,5,6을조사하는 혁신적인 도구가되었습니다. CyTOF를 사용하면 불소 표지 된 항체가 무거운 원소 리포터 표지 된 항체로 대체됩니다. 이 방법을 사용하면 스펙트럼 중복의 염려 없이 동시에 40개 이상의 마커를 측정할 수 있습니다. 사전 고갈 단계 또는 덤프 채널없이 그대로 생물학적 시편의 분석을 가능하게했다. 따라서, 우리는 기존의 2차원 유동 세포분석 플롯에서 고함량 치수성으로 조혈계를 종합적으로 볼 수 있습니다. 고갈 또는 게이팅 공정 동안 과거에 생략된 세포 집단은 이제 CyTOF4,5에의해 생성된 고차원 데이터로 빛을 가져올 수 있다. 우리는 동시에 골수성 보리 7에 초점을 맞춘 조혈 시스템에서 39 개의 매개 변수를측정하는 항체 패널을 설계했습니다. 기존의 유세포분석 데이터와 비교할 때 CyTOF에 의해 생성된 전례 없는 단세포 고차원 데이터의 해석과 시각화는 매우 까다롭습니다. 전산 과학자들은 고차원 데이터 세트의 시각화를 위한 차원 감소 기술을 개발했습니다. 이 문서에서는 T-분산 형 핵 종자 포함 (t-SNE) 기술을 사용하여 CyTOF 데이터를 분석하고 고차원 구조를 보존하면서 2 차원지도에 고차원 결과를 제시하는 알고리즘 viSNE을 사용했습니다. 데이터 8,9,10. tSNE 플롯에서 유사한 셀이 하위 집합으로 클러스터되고 색상이 셀의 특징을 강조 표시하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 1에 대해 골수성 세포는 CyTOF(도1)4로부터 유래된 33개의 표면 마커의발현 패턴의 유사성에 기초하여 여러 세포 서브세트로 분포된다. 여기에서 우리는 viSNE 분석 7에 의하여 우리의 이전에 보고된 39마커 CyTOF 패널을 가진 마우스 골수를 조사했습니다. 우리의 CyTOF 데이터의 viSNE 분석은 HSPC (CD117 ++) 및 호중구 (Ly6G+) 특성 을 모두 보여 준 미확인 세포 집단을 밝혀냈다 (도2)7.

결론적으로, 우리는 CyTOF 분석을 위한 신선한 전체 골수를 처리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 문서에서는, 우리는 예를 들면 마우스 골수를 이용했습니다, 이 프로토콜은 또한 인간적인 골수 견본을 가공하기 위하여 이용될 수 있는 동안. 인간 골수 견본에 특정한 세부 사항은 또한 프로토콜에서 또한 주의됩니다. 이 프로토콜의 장점은 전체 골수에 대한 조사를 가능하게하기 위해 전체 골수에서 호중구 혈통 세포를 보존하도록 최적화 된 인큐베이션 시간 및 온도와 같은 세부 사항을 포함하고 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 또한 형광 활성화 유동 세포 분석 응용 프로그램에 대해 용이하게 수정될 수 있다.

Protocol

모든 실험은 라호야 알레르기 및 면역학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침을 따랐으며, 설치류 사용에 대한 승인은 라 호야 알레르기 및 면역학 연구소에서 설명 된 기준에 따라 획득되었습니다. 건강의 국가 학회에서 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드. 1. 수확 마우스 골수 (BM) 상업 공급 업체에서 C57BL /6J 마우스를 구입. 병원균이 없는 시설에서 마이?…

Representative Results

도 1은 CyTOF 실험으로부터의 예로 제시된다. 이러한 tSNE 플롯상에서 여러 마우스 조직에 걸친 세포는 33-파라미터 CyTOF 패널에 의해 측정된 그들의 표면 마커 발현 프로파일의 유사성에 기초하여 서브세트로 군집되었다. 더 유사한 특성을 가진 세포는 각 세포상에 33개의 마커의 발현에 기초하여 호중구, 대식세포, 또는 DC와 같은 함께 자동으로 클러스터되었다. <p class="jove_c…

Discussion

지난 수십 년 동안, 형광 계류 세포측정은 세포 혈통 및 이질성을 연구하는 주요방법으로 사용되었다 1,2,3. 유세포측정법이 다차원 데이터를 제공했지만 이 방법은 매개 변수 와 스펙트럼 중복의 선택에 의해 제한됩니다. 유세포 분석의 약점을 극복하기 위해 우리는 형광단 대신 중금속 동위원소를 사용하여 검출기 채널 또는 …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 대량 세포 분석 절차에 도움을 LJI 흐름 세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01HL134236, P01HL136275 및 R01CA202987 (모두 C.C.H) 및 ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. 및 Y.P.Z)에 의해 지원되었다.

Materials

CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y Fluidigm Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb Fluidigm Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified Biolegend Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified Biolegend Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er Fluidigm Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified Biolegend Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd Fluidigm Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd Fluidigm Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er Fluidigm Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified Biolegend Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified Biolegend Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified Biolegend Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified Biolegend Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified Biolegend Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd Fluidigm Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd Fluidigm Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready ThermoFisher Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified Biolegend Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified Biolegend Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb Fluidigm Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb Fluidigm Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm Fluidigm Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified abcam Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho Fluidigm Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd Fluidigm (Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer CANDOR Bioscience Cat# 130050
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich Cat# A4503
Cisplatin-194Pt Fluidigm Cat# 201194
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer ThermoFisher Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ThermoFisher Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution GE Lifesciences Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir Fluidigm Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits Fluidigm http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich Cat# 158127
Sodium azide Sigma-Aldrich Cat# S2002
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# X100
Trypsin EDTA 1X Corning Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer Finck et al., 2013 https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank Cytobank https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0 Chen et al., 2016 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
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Diesen Artikel zitieren
Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H. Q., Marcovecchio, P., Wu, R., Hinz, D., Kim, C., Hedrick, C. C. Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells. J. Vis. Exp. (148), e59617, doi:10.3791/59617 (2019).

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