Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In den letzten Jahrzehnten waren Zytometrie-Methoden ein leistungsfähiges Werkzeug, um das hämatopoetische System im BM zu untersuchen. Zu diesen Methoden gehören fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie und die neue Methode der CyTOF mit schwermetallbeschriftten Antikörpern. Sie haben durch die Identifizierung ihrer einzigartigen Oberflächenmarker-Expressionsprofile zu Entdeckungen vieler Zelltypen in einer heterogenen biologischen Probe geführt. Erhöhte Spektrumüberlappungen, die mit mehr Kanälen verbunden sind, führen zu einer höheren Datenungenauigkeit in fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrieanwendungen. Daher werden unerwünschte Zellen routinemäßig entfernt, um Zellpopulationen von Interesse für die Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanalyse zu bereichern. Beispielsweise gelten Ly6G (oder Gr-1) und CD11b als reife myeloische Zellmarker und Ly6G⁺ (oder Gr-1⁺) und CD11b⁺ Zellen werden routinemäßig aus BM-Proben entfernt, indem magnetische Anreicherungskits verwendet werden, bevor die Durchflusszytometrieanalyse hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) oder durch Kombination dieser Marker in einem Dump-Cocktail-Kanal^1,2,3. Ein weiteres Beispiel ist, dass Neutrophile routinemäßig aus menschlichen Blutproben entfernt werden, um periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) für immunologische Studien anzureichern. Ganzes Knochenmark, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, wird jedoch selten intakt für die Zytometrieanalyse untersucht.

In letzter Zeit ist CyTOF zu einem revolutionären Werkzeug geworden, um das hämatopoetische System^4,5,^6zuuntersuchen. Mit CyTOF werden die fluorophor-markierten Antikörper durch schwere, von Reportern gekennzeichnete Antikörper ersetzt. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von über 40 Markern ohne die Sorge um die Überlappung des Spektrums. Es hat die Analyse intakter biologischer Proben ohne Vorabbauschritte oder einen Deponiekanal ermöglicht. Daher können wir das hämatopoetische System umfassend mit hoher Content-Dimensionalität aus herkömmlichen 2D-Flow-Zytometrie-Plots betrachten. Zellpopulationen, die in der Vergangenheit während des Erschöpfungs- oder Gatingprozesses weggelassen wurden, können nun mit den von CyTOF^4,5erzeugten hochdimensionalen Daten ans Licht gebracht werden. Wir haben ein Antikörper-Panel entwickelt, das gleichzeitig 39 Parameter im hämatopoetischen System misst, mit einem Fokus auf die myeloische Linage⁷. Im Vergleich zu den herkömmlichen Flow-Zytometrie-Daten ist die Interpretation und Visualisierung der beispiellosen einzelzelligen hochdimensionalen Daten, die von CyTOF generiert werden, eine Herausforderung. Computerwissenschaftler haben Maßalitätsreduktionstechniken zur Visualisierung hochdimensionaler Datensätze entwickelt. In diesem Artikel verwendeten wir den Algorithmus viSNE, der t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) Technik verwendet, um die CyTOF-Daten zu analysieren und das hochdimensionale Ergebnis auf einer 2-dimensionalen Karte zu präsentieren, während die hochdimensionale Struktur konserviert wird. der Daten^8,9,10. Im tSNE-Diagramm werden ähnliche Zellen in Teilmengen gruppiert, und die Farbe wird verwendet, um das Feature der Zellen hervorzuheben. In Abbildung 1 werden die myeloischen Zellen z. B. in mehrere Zellteilmengen verteilt, basierend auf den Ähnlichkeiten ihrer Expressionsmuster von 33 Oberflächenmarkern, die aus CyTOF resultieren (Abbildung 1)⁴. Hier untersuchten wir Mausknochenmark mit unserem zuvor berichteten 39-Marker CyTOF Panel durch viSNE-Analyse⁷. viSNE-Analyse unserer CyTOF-Daten ergab eine nicht identifizierte Zellpopulation, die sowohl HSPC -(CD117⁺) als auch Neutrophilen (Ly6G⁺) Merkmale zeigte (Abbildung 2)⁷.

Abschließend stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung eines frischen ganzen Knochenmarks für die CyTOF-Analyse vor. In diesem Artikel haben wir als Beispiel Mausknochenmark verwendet, während dieses Protokoll auch zur Verarbeitung menschlicher Knochenmarkproben verwendet werden kann. Die spezifischen Details für menschliche Knochenmarkproben sind auch im Protokoll vermerkt. Der Vorteil dieses Protokolls ist, dass es Details wie Inkubationszeit und Temperatur enthält, die optimiert wurden, um Neutrophilen-Linienzellen im gesamten Knochenmark zu erhalten, um eine Untersuchung des intakten gesamten Knochenmarks zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann auch leicht für Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanwendungen geändert werden.