Summary

Targeting Alfa Synuclein aggregaten in cutane perifere zenuwvezels door Free-floating immunofluorescentie assay

Published: June 25, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor een vrij zwevende indirecte immunofluorescentie assay op de huid biopsie secties die het mogelijk maakt voor de identificatie van de ziekte specifieke conformatie varianten van Alfa synuclein betrokken bij de ziekte van Parkinson en meerdere eiwitten van de perifere zenuwstelsel.

Abstract

Tot op heden is voor de meeste neurodegeneratieve ziekten alleen een post-mortem histopathologisch definitieve diagnose beschikbaar. Voor de ziekte van Parkinson (PD), de diagnose nog steeds berust alleen op klinische symptomen van de motor betrokkenheid die later verschijnen in de ziekte natuurlijk, wanneer de meeste van de Dopaminerge neuronen zijn al verloren. Daarom is er een sterke behoefte aan een biomarker die patiënten kunnen identificeren aan het begin van de ziekte of op het risico van de ontwikkeling ervan. In de afgelopen jaren, huid biopsie heeft bewezen een uitstekend onderzoek en diagnostisch hulpmiddel voor perifere zenuwziekten zoals kleine vezel neuropathie. Interessant is dat een kleine Fiber neuropathie en Alfa synuclein (αSyn) neurale deposito’s zijn aangetoond door huid biopsie bij PD patiënten. Inderdaad, huid biopsie heeft het grote voordeel dat het een gemakkelijk toegankelijke, minimaal invasieve en pijnloze procedure die het mogelijk maakt de analyse van perifeer zenuwweefsel vatbaar voor de pathologie. Bovendien, de mogelijkheid van het herhalen van de huid biopsie in de loop van de follow-up van dezelfde patiënt maakt het bestuderen van de longitudinale correlatie met de progressie van de ziekte. We zetten een gestandaardiseerd betrouwbaar protocol om de aanwezigheid van αSyn aggregaten in de huidzenuw vezels van de PD patiënt te onderzoeken. Dit protocol omvat weinig korte fixatie stappen, een cryotome en vervolgens een vrij zwevende immunofluorescentie Double-kleuring met twee specifieke antilichamen: anti-eiwit gen product 9,5 (PGP 9.5) om de cutane zenuwvezels en anti 5G4 voor het opsporen van merk αSyn aggregaten. Het is een veelzijdig, gevoelig en gemakkelijk uit te voeren protocol dat ook kan worden toegepast voor het richten van andere eiwitten van belang in de huid zenuwen. De mogelijkheid om αSyn aggregaten merk is een andere stap voorwaarts om het gebruik van huid biopsie als een instrument voor de vaststelling van een pre-mortem histopathologisch diagnose van PD.

Introduction

Huid biopsie heeft verworven een groot belang als de diagnostische en Research Tool op het gebied van neurologische aandoeningen1. Inderdaad, epidermis en dermis bevatten overvloedige somatische zintuiglijke zenuwvezels (gemyeliniseerde en mergloze), Nociceptieve vrije zenuwuiteinden, zintuiglijke receptoren en autonome innervatie van zweetklieren, schepen, talgklieren en spier arrector pilorum 2.

In het midden van de 20e eeuw, de Setup voor Immunohistochemistry van PGP 9.5 antilichaam toegestaan het bewijs van een uitgebreide innervatie van de menselijke epidermis zoogdier huid3. PGP 9.5 is een carboxyl-Terminal hydrolase gelijkelijk verdeeld langs axons van zowel het centrale en perifere zenuwstelsel (PNS). De beschikbaarheid van dit antilichaam liet niet alleen toe om de morfologie en de anatomie van PNS in de huid te verduidelijken maar ook uitgevoerd de studie van ziekten verbonden aan het3,4. Huid biopsie bijgedragen aan het definiëren van een nieuwe klinische entiteit: de kleine vezel neuropathie. Verschillende internationale groepen toonden de associatie tussen het verlies van intraepidermal zenuwvezels en symptomen/tekenen van kleine Fiber neuropathie5 door de huid biopsie analyse en mits gestandaardiseerde protocollen voor zenuw morphometry evenals normatieve referentiewaarden die in de klinische praktijk6,7,8moeten worden gebruikt.

Onlangs heeft een grote hoeveelheid bewijsmateriaal aangetoond dat neurodegeneratieve ziekten, gekenmerkt door misgevouwen eiwit accumulaties in het centrale zenuwstelsel, zijn multi-systeem pathologieën9. Inderdaad, PD wordt gekenmerkt door αSyn accumulatie in de Dopaminerge neuron van Substantia nigra, maar het is aangetoond dat αSyn en haar pathologische vorm, phosphorylated ΑSyn (P-αSyn), ook kan worden gedetecteerd in de perifere weefsels. Gastro-intestinale mucosa10, speekselklieren11, huid autonome vezels omringende zweetklieren en pilomotor spieren12,13,14, tonen immunoreactivity aan pathogene vormen van αSyn, in overeenstemming met de hypothese van braak dat intrigerend postulaat dat αSyn de pathologie kan in PNS goed vooraf beginnen, vóór zijn accumulatie in hersenen15. Verder, de aanwezigheid van p-αSyn is aangetoond in de huid zenuwen van patiënten met rem gedragsstoornissen die worden beschouwd als prodromal PD16,17 dus huid pathologische αSyn kan worden beschouwd als een veelbelovende vroege perifere histopathologisch marker van synucleinopathy.

De vereniging van kleine vezel neuropathie in PD is eerder aangetoond en het is gebleken dat intraepidermal zenuwvezels dichtheid weerspiegelt progressie van de ziekte18,19. Vandaar, de huid biopsie is een nuttig instrument voor het bestuderen van neurodegeneratie in PD en voor de vaststelling van een pre-mortem histopathologisch diagnose van de ziekte. Inderdaad, huid biopsie heeft een groot voordeel van een gemakkelijk toegankelijke en minimaal invasieve procedure, waardoor de analyse van het zenuwweefsel vatbaar voor de pathologie. Ten slotte, de mogelijkheid van het herhalen van de huid biopsie in de loop van de follow-up van dezelfde patiënten maakt het bestuderen van de longitudinale correlatie met progressie van de ziekte.

In ons laboratorium, het exploiteren van een dubbele immuun-kleuring met PGP 9.5 en de conformatie-specifieke monoclonal 5G4 antilichaam, dat de ziekte specifieke vormen van αSyn met inbegrip van kleine aggregaten20,21erkent, waren we in staat om aan te tonen de aanwezigheid van αSyn aggregaten in huid zenuwen met een veelbelovende hoge diagnostische efficiëntie19. Immunofluorescentie analyse van de huid biopsie in conformationele ziekten onderscheidt zich als een veelbelovende bron van biomarkers door het combineren van zowel de opsporing van eiwit aggregaten en de maatregel van de neurodegeneratie in vivo. Hierna illustreren we een eenvoudig en veelzijdig protocol over de behandeling van de huid biopsie en het uitvoeren van de vrij zwevende immunofluorescentie kleuring voor het opsporen van αSyn aggregaten. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor het richten van een andere proteïne van belang, uitgedrukt in huid PNS.

De volgende studie protocol is gebruikt om de diagnostische nut van geaggregeerde αSyn analyse in de PNS van PD door de huid biopsie19te evalueren. De criteria van de opneming voor PD waren: een welomlijnde klinische diagnose volgens de Britse kenmerkende criteria van de hersenen Bank, ziekteduur minstens 3 jaar, geen familiegeschiedenis, en geen belangrijke cognitieve stoornis of belangrijke dysautonomic symptomen in de geschiedenis. Uitsluitingscriteria waren bekende oorzaken van neuropathie (versuikerde hemoglobine, creatinine, vitamine B12, TSH, serum immunofixation, HIV, HCV, syfilis, en Borreliosis). Elk onderwerp onderging aan 3 mm-diameter huid biopten bij drie anatomische plaatsen (hals bij C8 dermatomale niveau, dij 10 cm boven de knie, been 10 cm boven zij malleolus) aan de kant, die klinisch meer werd beïnvloed. In het algemeen, het volgende protocol is over de behandeling van de huid biopsie en het uitvoeren van de vrij zwevende immunofluorescentie kleuring en analyse. Vandaar kan het worden aangepast en worden gebruikt voor de opsporing van andere proteïnen van belang in huidweefsel.

Protocol

Het protocol is goedgekeurd door de Cantonal ethische Commissie en alle ingeschreven onderwerpen hebben schriftelijk geïnformeerde toestemming gegeven aan de studie. 1. huid biopsie collectie Laat een gekwalificeerde arts de huid biopsie uit te voeren in een passende klinische setting. Kies het gebied om de huid biopsie uit te voeren en schoon met een alcoholdoekje. Bereid de verdoving oplossing met 1 CC van lidocaïne 2%. Met de naald parallel aan het …

Representative Results

Naar aanleiding van de beschreven procedure (Figuur 1), we gedetecteerd αSyn aggregaten, gelabeld met 5G4 antilichaam, in dermale zenuwbundels innervating autonome structuren van PD patiënten. De morfologie van Alfa-synuclein deposito’s verschijnt als een gestippelde signaal langs de axonen van de huid zenuwen (Figuur 2). Inderdaad, het exploiteren van dit protocol in 19 PD patiënten en 17 controles in de huid biopten op drie anatomische site (cervicale, dij …

Discussion

We beschrijven een vrij zwevende immunofluorescentie assay voor huid biopten voor de diagnose van PD: het exploiteert dubbele immunokleuring met anti-PGP 9.5 antilichaam, een panaxonal marker, en anti-5G4, een conformatie specifieke antilichaam dat de geaggregeerde vorm erkent van αSyn.

De grote voordelen van huid biopsie voor diagnostische doeleinden in PD en eventueel in andere eiwit conformatie stoornissen zijn: 1) de directe toegang tot zenuwweefsel vatbaar voor ziekte door een licht inva…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Parkinson Schweiz en ABREOC (de wetenschappelijke adviesraad voor onderzoek van de Ospedaliero Cantonale) voor hun financiële steun aan deze studie.

Materials

5G4 (anti human αSyneclein 5G4) Analytik Jena Roboscreen 847-0102004001 Mouse monoclonal 
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG  Invitrogen 1971418 2mg/ml
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG  Invitrogen 1922849 2mg/ml
Disodium hydrogen phosphate solution Merk Millipore 106586
Ethylene Glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G7757
L-Lysine monohydrochloride Sigma-Aldrich L5626
Paraformaldehyde Aldrich Chemistry 441244
PGP9.5 Abcam ab15503 Rabbit polyclonal
Sodium Chloride Sigma  S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck Millipore 106346
Sodium (meta)periodate  Sigma-Aldrich S1878
Trizma Base Sigma  T1503
Tryton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield  Vector Laboratories H-1000 Mounting medium

Referenzen

  1. McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist’s Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
  2. Wilkinson, P. F., Millington, R. . Skin. , 49-50 (2009).
  3. Weddell, G., et al. Nerve endings in mammalian skin. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).
  4. Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
  5. Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
  6. McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
  7. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
  8. Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
  9. Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
  10. Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson’s disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
  11. Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
  12. Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
  13. Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson’s disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
  14. Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson’s disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
  15. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
  16. Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
  17. Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
  18. Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
  19. Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
  20. Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
  21. Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Vacchi, E., Pinton, S., Kaelin-Lang, A., Melli, G. Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay. J. Vis. Exp. (148), e59558, doi:10.3791/59558 (2019).

View Video