Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

A biópsia cutânea adquiriu grande importância como ferramenta diagnóstica e de pesquisa no campo das desordens neurológicas¹. Na verdade, a epiderme e a derme contêm abundantes fibras nervosas sensoriais somáticas (mielinizadas e não mielinizadas), terminações nervosas livres nociceptivas, receptores sensoriais e inervação autonômica de glândulas sudoríparas, vasos, glândulas sebáceas e músculo arrector arrectores ^{o 2}.

Em meados do século 20 , a instalação de imunoistoquímica do anticorpo PGP 9.5 permitiu a evidência de uma extensa inervação da epiderme humana³. O PGP 9.5 é um hidrolase do carboxyl-terminal distribuído ingualmente ao longo dos axônios do sistema nervoso central e periférico (PNS). A disponibilidade deste anticorpo permitiu não apenas esclarecer a morfologia e a anatomia da PNS na pele, mas também implementar o estudo de doenças associadas a ele^3,4. A biópsia da pele contribuiu a definir uma entidade clínica nova: a neuropatia pequena da fibra. Diversos grupos internacionais demonstraram a associação entre a perda de fibras de nervo intraepidérmicas e os sintomas/sinais da neuropatia pequena da fibra⁵ pela análise da biópsia da pele e forneceram protocolos estandardizados para a morfometria do nervo assim como valores de referência normativos a serem utilizados na prática clínica^6,7,8.

Recentemente, uma grande quantidade de evidências mostrou que as doenças neurodegenerativas, caracterizadas por acumulações de proteínas desdobradas no sistema nervoso central, são patologias multissistema⁹. Na verdade, a DP é caracterizada por acúmulo de αsyn no neurônio dopaminérgico de substância negra nigra, mas tem sido demonstrado que αsyn e sua forma patológica, αsyn fosforilada (P-αsyn), poderiam ser detectadas também nos tecidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal¹⁰, glândulas salivares¹¹, fibras autonômicas da pele que cercam as glândulas sudoríparas e os músculos pilomotores^12,13,14, mostram imunoreatividade a formas patogênicas de αsyn, em acordo com a hipótese de Braak que postular intrigantemente que a patologia de αSyn pode começar no PNS bem adiantado, antes de sua acumulação no cérebro¹⁵. Além disso, a presença de p-αsyn foi demonstrada em nervos cutâneos de pacientes com distúrbios do comportamento REM, que são considerados PD^16,17 assim, a pele patológica αsyn pode ser considerada um promissor periférico precoce marcador histopatológico de sinucleinopatia.

A associação da neuropatia pequena da fibra no paládio foi demonstrada previamente e verificou-se que a densidade intraepidérmicas das fibras de nervo reflete a progressão da doença^18,19. Daqui, a biópsia da pele é uma ferramenta útil para estudar a neurodegeneração no paládio e para estabelecer um diagnóstico histopatológico pre-mortem da doença. Na verdade, a biópsia da pele tem uma grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível e minimamente invasivo, permitindo a análise do tecido nervoso propenso à patologia. Finalmente, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento dos mesmos pacientes permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença.

Em nosso laboratório, explorando um immuno-mancha dobro com PGP 9.5 e o anticorpo 5g4 monoclonal conformation-específico, que reconhece formulários específicos da doença de αsyn que incluem agregados pequenos^20,21, nós pudemos mostrar o presença de agregados de αSyn nos nervos da pele com uma eficiência diagnóstica elevada prometedora¹⁹. A análise da imunofluorescência da biópsia da pele em doenças conformacional destaca-se como uma fonte promissora de biomarcadores, combinando tanto a detecção de agregados proteicos quanto a medida da neurodegeneração in vivo. Daqui por diante, nós ilustramos um protocolo fácil e versátil em segurar a biópsia da pele e em executar a mancha da imunofluorescência da livre-flutuação para detectar agregados do αSyn. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para alvejar toda a outra proteína do interesse expressada no PNS da pele.

O seguinte protocolo de estudo tem sido utilizado para avaliar a utilidade diagnóstica da análise de αSyn agregada na PNS de DP por biópsia cutânea¹⁹. Os critérios de inclusão para DP foram: um diagnóstico clínico definitivo de acordo com os critérios diagnósticos do banco do cérebro do Reino Unido, duração da doença pelo menos 3 anos, sem antecedentes familiares e sem comprometimento cognitivo maior ou sintomas dissautonômicos maiores na história. Os critérios de exclusão foram causas conhecidas de neuropatia (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, Imunofixação sérica, HIV, HCV, sífilis e borreliose). Cada sujeito foi submetido a biópsias cutâneas de 3 mm de diâmetro em três sítios anatômicos (pescoço no nível dermatomal C8, coxa 10 cm acima do joelho, perna 10 cm acima do maléolo lateral) no lado, o que foi clinicamente mais afetado. Geralmente, o seguinte protocolo é sobre a manipulação da biópsia da pele e a realização da coloração e da análise livre-flutuantes da imunofluorescência. Daqui pode ser adaptado e usado para a deteção de outras proteínas do interesse no tecido da pele.