Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Meerdere epigenome-bewerken platformen zijn onlangs ontwikkeld te richten op een DNA-sequenties in de regio’s waarmee gene expression^1,2. De gemaakte epigenome-bewerkingsgereedschap zijn ontworpen om (i) het reguleren van transcriptie, (ii) veranderen posttranslationele histone modificaties, (iii) wijzigen methylation van DNA en (iv) het moduleren van regelgevende element interacties. De aanpak van het verankeren van de transcriptie/chromatine modifiers om een gedeactiveerde (dode) Cas9 (dCas9) verhoogd van eerder ontwikkelde epigenome-bewerken platforms, zoals zink eiwitten (ZFPs) en transcriptie activator-achtige effectoren (verhalen), vinger herbergen een potente transcriptionele effector domein (ED) gesmolten aan het ontworpen DNA-bindende domein (DBD)³. De resultaten van het gewenste fenotype zoals activering of repressie wordt gedefinieerd door het effector molecuul verankerd aan de endogene loci (Figuur 1). Als u wilt maken van programmeerbare transcriptionele activators, zijn dCas9/gRNA modules gekoppeld aan VP16^4,5,6 (figuur 1A), een virale activering domein dat Pol II en de algemene transcriptie machines werft. De wijziging van dit systeem heeft VP64, een tetrameer van VP16 domeinen, die een nog robuustere activering tarief^5,–⁶bieden: opgenomen. Het systeem heeft met succes gewerkt codering en noncoding regio’s activeren door zich te richten initiatiefnemers en regelgevende elementen. Nog belangrijker is, hoewel VP64 moleculen niet rechtstreeks de structuur van de chromatine in de target-regio wijzigen, werft het chromatine modifiers dat resultaten in depositie van de actieve (euchromatine) merken bindt, met inbegrip van H3/H4 acetylation en H3-K4 di / Tri-methylering^5,6. Naast VP64, heeft de p65-subunit van de menselijke NF-recombination complex is vastgebonden aan de dCas9/gRNA module⁷. Interessant, het binden van deze effectoren aan de regio’s stroomopwaarts van transcriptie start sites (TSSs) en binnen initiatiefnemers resulteert in een sterke gen-inductie. VP64 en p65 effectoren kunnen echter ook de activatory effecten uitoefenen terwijl het wordt gekoppeld aan de regio’s gelegen stroomafwaarts van TSSs en op de versterkers van de distale^7,8. Om een meer robuuste transcriptionele antwoord ontlokken, moeten meerdere dCas9-VP64 of dCas9-p65-fusies worden aangeworven naar een enkel doel locus^9,10. Als zodanig, heeft de recente ontwikkeling van volgende-generatie activators, die meerdere effector domeinen door een enkele dCas9-gRNA-complex, zoals SunTag werven, geleid tot een sterkere activering vermogen te vergelijken met dCas9-VP64 fusion tegenhangers^{11 , 12}. een verbeterde transcriptionele activering is verkregen door middel van de fusie van VP64, p65 en Rta (VPR), een domein van de transactivation van de gamma-infectieziekte, aan de C-terminus van dCas9¹³ (figuur 1A). Vergelijkbare CRISPR/dCas9-systemen hebben ontwikkeld voor doelgroepen gerichte repressie (figuur 1B).

Endogene gene repressie kan worden bereikt met gemanipuleerde onderdrukker fusies via allerlei mechanismen (figuur 1B). Is gebleken dat CRISPR/dCas9 systemen, gekoppeld aan de onderdrukker DBD (zelfs zonder een effector domein/s), efficiënt genexpressie zwijgen kunnen terwijl vastgebonden aan een promotor of stroomopwaarts/stroomafwaarts-TSS regio’s^{3,6 ,14}. De gevolgen voor de transcriptie wordt veroorzaakt door de sterische inmenging van transcription factor binding en RNA polymerase verwerking. Echter zijn uitgebreidere benaderingen nodig, zoals gene repressie door de sterische hinder alleen vaak niet voor robuuste silencing volstaat. De recente ontwikkeling van de volgende generatie van geluiddempers op basis van CRISPR/dCas9 systemen uitvoering transcriptionele onderdrukker domeinen (TRDs), histone modifiers (H3-K9 di-/ tri-methylering, H3-K27 di-/ tri-methylering; H3-K36 di-/ tri-methylering, H3/H4 deacetylation), en methylation van DNA (CpG) leidde tot de bouw van epigenetische hulpmiddelen waardoor meer robuuste silencing effecten^{4,5,15,16, 17,18,19,20}. Het is aangetoond dat de aanwerving van deze epigenetische modifiers tot het DNA dat kan leiden tot de vorming van meer gesloten en gecondenseerde chromatine, die meestal een meer potente silencing resultaat^21,22te genereren. De meest voorkomende silencing domein gebruikt met DBDs is de Krüppel-geassocieerde vak (KRAB)^4,5. De aanwerving van de factor is gebleken om te corresponderen met de chromatine wijzigingen; de mechanismen van deze wijzigingen zijn echter nog opgehelderd^16,17,18. Onlangs is gebleken dat de lokalisatie van KRAB aan DNA kan de bevordering van de vergadering van de Histon methyltransferase SETDB1 en de Histon deacetylation (HDAC) NuRD complexen, suggereren de mogelijkheid dat deze interacties de vorming van bemiddelen condensatie van de chromatine en transcriptionele silencing^3,13. Als een alternatieve benadering, kunnen effector domeinen worden gesmolten tot DBDs maken van een aangepaste epigenetische silencing eiwit. Dit systeem katalyseert direct repressieve DNA merken of Histon modificaties.

Onlangs, heeft het gebruik van synthetische CRISPR/dCas9 systemen vastgebonden aan het DNMT3A enzym is voorzien voor transcriptionele deactivering. DNMT3A katalyseert methylation van DNA die transcriptionele onderdrukking tijdens de vorming van heterochromatin op de endogene gene initiatiefnemers en andere regelgevende gebieden (figuur 1B)^{18,20 oefent}. McDonald et al.¹⁸ en²⁰ van de Vojta et al. waren de eerste auteurs om te melden dat methylation van DNA kan worden gebruikt voor epigenome-gen zwijgen of repressie, waaruit blijkt dat de plasmide-geleverd dCas9-DNMT3A fusiesysteem krachtiger kunt verbeteren Cytosine methylering rond de TSS^18,20. McDonald en collega’s aangetoond dat de werkgelegenheid van de strategie kan leiden tot een aanzienlijke vermindering (ongeveer 40%) in een tumor suppressor gen niveaus CDKN2A mRNA¹⁸. Ook toont gericht op de regio unmethylated promotor van de BACH of IL6ST genen verhoogde CpG methylering die heeft zijn gecorreleerd met een dubbele afname de gen expressie²⁰. Onze lab heeft onlangs het gebruik van methylation van DNA voor de pathologische uitkomsten van SNCA overexpressie (Figuur 2)²³verzachtende voorzien. De strategie is gebaseerd op selectieve verbetering in methylation van DNA binnen de SNCA intron 1 regio, zoals het voorheen werd gerapporteerd als hypomethylated in PD en dementie met Lewy organen (DLB) hersenen^{24,25, 26}. Deze hypomethylation is gekoppeld aan SNCA overexpressie, waardoor een aantrekkelijk doelwit voor therapeutische interventie^24,27,28. We toonden onlangs een laag niveau van methylation van DNA in de SNCA intron 1 regio hiPSC afkomstige Dopaminerge NPC’s verkregen uit een PD-patiënt met de SNCA verdrievoudiging²³. Het voordeel van deze experimentele model is dat de NPC’s kunnen krachtig in de cultuur doorgegeven of onderscheid gemaakt volwassen neuronen tussen, waardoor een efficiënte screening genetische factoren die cellulaire fenotypen bemiddelen, met inbegrip van oxidatieve te identificeren stress en apoptosis²⁹. Dit modelsysteem maakt bovendien wetenschappers te recapituleren de ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenissen die vóór aanvang van de symptomen in patiënten plaatsvonden. Daarnaast vertegenwoordigen hiPSC afkomstige NPC’s een geweldig hulpmiddel voor het testen van de trajecten van het cellulaire en moleculaire genexpressie is gekoppeld. Nog belangrijker is, kunnen hiPSC afkomstige NPC’s gecombineerd met state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome technologie sterk bevordert de ontwikkeling van ‘next-generation drugs’ voor vele neurodegeneratieve ziekten.

Verklein pathologische niveaus van SNCA meningsuiting en ontwikkelden we onlangs een lentivirus gebaseerde systeem die een fusieproteïne dCas9-DNMT3A en gRNA tot specifiek doelwit CpG methylering binnen de SNCA intron 1 (figuur 2A)²³. Dit protocol zal lentivirale vector (LV) ontwerp en productie in detail worden beschreven. LVs vertegenwoordigen een doeltreffend middel voor het leveren van CRISPR/dCas9 onderdelen voor verschillende redenen, namelijk (i) hun vermogen om te voeren omvangrijk DNA inserts, (ii) een hoog rendement van een breed scala van cellen, met inbegrip van zowel de nondividing als de scheidslijn cellen^{30 transducing} , en (iii) hun vermogen voor het opwekken van minimale cytotoxische en immunogene reacties. Onlangs, we de LV-systeem toegepast op hiPSC afkomstige Dopaminerge neuronen van een patiënt met de verdrievoudiging van het SNCA locus en aangetoond dat het therapeutisch potentieel van LVs voor de levering van epigenome-bewerken methylering tools²³ ( Figuur 2B). Inderdaad, een LV-gRNA/dCas9-DNMT3A-systeem zorgt ervoor dat een aanzienlijke toename in methylation van DNA op de SNCA intron 1 regio. Deze stijging komt overeen met de vermindering van de niveaus van SNCA mRNA en eiwit²³. Bovendien redt SNCA Downregulatie PD-gerelateerde fenotypen in de SNCA verdrievoudiging/hiPSC-afgeleid Dopaminerge neuronen (bijvoorbeeld mitochondriale ROS productie en cel levensvatbaarheid)²³. Nog belangrijker is, we laten zien dat de vermindering in SNCA expressie door de LV-gRNA-dCas9-DMNT3A-systeem geschikt is voor het omkeren van de fenotypen die kenmerkend voor hiPSC afkomstige Dopaminerge neuronen van een PD-patiënt die het droegen SNCA verdrievoudiging, zoals mitochondriale ROS productie en cel levensvatbaarheid²³. Het doel van dit protocol is 1) te schetsen van het protocol van de productie en de concentratie van een geoptimaliseerde LV-platform voor het genereren van virale preparaten hoge-tittered en 2) voor het beschrijven van de differentiatie van hiPSCs naar NPC’s patroon om te worden volwassen Dopaminerge neuronen^31,32 en de karakterisatie van de niveaus van de methylering van de gerichte regio binnen SNCA intron 1.

Lentivirale platformen hebben een groot voordeel ten opzichte van het meest populaire platform van de vector, namelijk adeno-geassocieerde vectoren (AAVs), die is van de eerstgenoemde mogelijkheid voor grotere genetische inzetstukken^33,34. AAVs kan worden opgesteld tegen aanzienlijk hogere opbrengsten maar een lage verpakking capaciteit bezitten (< 4.8 kb), het gebruik ervan voor het leveren van alles-in-één CRISPR/Cas9 systemen in gevaar te brengen. Dus, lijkt het dat het LVs zou de platform-van-keuze in de toepassingen die betrokken zijn bij de levering van CRISPR/dCas9 hulpmiddelen. Het protocol hier geschetst zal dus een waardevol instrument voor onderzoekers verlangend te het effectief bewerken van epigenome componenten te leveren aan de cellen en organen. Het protocol verder schetst de strategie om te vergroten de mogelijkheden van het productie- en expressie van de vectoren via een wijziging in cis van de elementen in de vector expressie cassette^30,35. De strategie is gebaseerd op de roman systeem ontwikkeld en studeerde in ons lab en wijst op haar vermogen om te produceren van virale deeltjes in de range van 10¹⁰ virale eenheden (VU) /mL^30,35.