慢病毒载体平台, 用于将表观基因编辑工具高效地传递到人类诱导的多能干细胞衍生疾病模型中

最近开发了多个表观基因组编辑平台, 针对控制基因表达^1,2的区域中的任何 dna 序列。创建的表观基因组编辑工具旨在 (i) 调节转录, (ii) 改变翻译后组蛋白修饰, (iii) 修改 DNA 甲基化, (四) 调节调控元素相互作用。将转录-染色质改性剂固定到从以前开发的表观基因编辑平台 (如锌指蛋白 (Zfp) 和转录激活剂 (Tals) 中提出的失活 (死) Cas9 (Dcas9) 的方法,具有强大的转录效应域 (ED) 融合到设计的 dna 结合域 (DBD)³。所需表型 (如激活或抑制) 的结果由锚定在内源位点上的效应分子定义 (图 1)。为了创建可编程转录激活剂, dcas9/grna 模块与 vp16^4、5、6 (图 1a) 相连, 这是一个病毒激活域, 它招募了 pol ii 和一般转录机制。该系统的修改包括 vp64, vp16 域的四聚体, 提供了更强大的激活率^5,6。该系统已成功地用于通过定位促进者和调控元素激活编码和非编码区域。重要的是, 尽管 VP64 分子不会直接改变目标区域中的染色质结构, 但它会招募染色质改性剂, 从而结合活性 (染色质) 标记的沉积, 包括 hh/H4 乙酰化和 H3-k4 二/三甲基化^5,6。除 VP64 外, 人类 nf-b 复合体的 p65 亚基还与 dCas9/gRNA 模块⁷相连。有趣的是, 这些效应因子与转录起始位点 (Tss) 上游区域和启动子内的连接会导致强基因诱导。然而, vp64 和 p65 效应器也可以发挥激活作用, 同时与位于 tss 下游和远端增强器^7,8的区域相连。为了获得更有力的转录反应, 需要招募多个 dcas9-vp64 或 dcas9-p65 融合到一个单一的目标位点^9,10。因此, 与 Dcas9-vp64 融合对应者相比, 最近开发的下一代激活器通过 suntag 等单个 Dcas9-grna 复合体招募多个效应域^,从而提高了激活能力11^,12. 通过将 vp64、P65 和 RTA (vpr)—-从γ-疱疹病毒到 dcas9 13 c-末端的转激活域—-融合在一起, 获得了更好的转录激活 (图 1 a)。为针对具体目标的镇压开发了类似的 Crispr/cas9 系统 (图 1b)。

内源基因抑制可以通过工程抑制融合通过各种机制实现 (图 1b)。已经证明, crispr/dcas9 系统与抑制 dbd 相连 (即使没有效应因子 domain s), 可以有效地沉默基因表达, 同时与启动子或上流-向下-tss 区域^{3,6 ,14}。转录因子结合和 RNA 聚合酶处理对转录的影响是由类固醇干扰引起的。然而, 需要更全面的方法, 因为仅仅通过位块来抑制基因往往不足以进行强有力的沉默。基于 Crispr/cas9 系统的消音器的最新发展, 该系统具有转录抑制域 (Trd)、组蛋白修饰剂 (H3-k9-Di-t”甲基化、H3-k27—-三甲基化;h3-k36-/三甲基化, h h4 去乙酰化) 和 dna (cpg) 甲基化导致表观遗传工具的构建, 允许更强大的沉默效果^4,5,15,^{16, 17,18,19,20}。已经证明, 这些表观遗传修饰剂的制备 dna 可能会导致形成更封闭和浓缩的染色质, 这通常会产生更有效的沉默结果^21,22。dbd 最常用的静音域是与 Krüppel-associated 的盒子 (krab)^4,5。该因子的招募已被证明与染色质的变化相对应;然而, 这些修改的机制还有待阐明 16^、17、18。最近, 已经证明, KRAB 定位 DNA 可以促进组蛋白甲基转移酶 SETDB1 和组蛋白去乙酰化 (HDAC) NuRD 复合物的组装, 这表明这些相互作用介导形成的可能性。染色质凝结和转录沉默^3,13。作为另一种方法, 效应域可以与 Dbd 融合, 以创建自定义表观遗传沉默蛋白。该系统直接催化抑制性 DNA 标记或组蛋白修饰。

最近, 使用与 DNMT3A 酶结合的合成 Crispr/cas9 系统已被重新用于转录失活。dnmt3a 催化 dna 甲基化, 在内源性基因启动子和其他调控区域异染色质形成过程中进行转录抑制 (图 1b)^18、20。McDonald等人, 18岁和 vojta等人, 是第一个报告 dna 甲基化可用于表观基因沉默或抑制的作者, 这表明等离子体交付的 dcas9-dnmt3a 融合系统可以有效地增强胞嘧啶甲基化在 tss^18,20附近。麦当劳和同事证明, 该战略的使用可能会导致大幅减少 (约 40%)在肿瘤抑制基因中, CDKN2A mrna 水平^{为 18}。同样, 针对bach或il6st基因的非甲基化启动子区域显示 cpg 甲基化增加, 这与基因表达20的两倍减少有关.我们的实验室最近重新使用 DNA 甲基化来减轻Snca过度表达的病理结果 (图 2)²³。该策略的基础是选择性增强snca内含子1区域内的 dna 甲基化, 因为它以前曾报道过在 pd 和痴呆与莱维体 (dlb) 大脑^24,25的低甲基化^{, 26岁}这种低甲基化与snca过度表达有关, 从而为治疗干预提供了一个有吸引力的目标 24^,27,28。我们最近在 hpscc 衍生的多巴胺能 npc 中的 Snca 内含子1区域中显示了低 DNA 甲基化水平, 这些 Nbc 是从一个患有 snca三联23的 pd 患者获得的. 这种实验模型的优点是, Npc 可以在培养中有力地繁殖或进一步分化为成熟的神经元, 从而能够有效地筛选, 以识别调节细胞表型的遗传因素, 包括氧化压力和细胞凋亡29。此外, 该模型系统使科学家能够重述患者症状出现前发生的发育事件。此外, hpsc 衍生的 Npc 是测试与基因表达相关的细胞和分子途径的重要工具。重要的是, hepc 衍生的 Npc 与最先进的 Crisprus-epigenome 技术相结合, 可以极大地促进许多神经退行性疾病的 “下一代药物” 的开发。

为了降低 SNCA 表达的病理水平, 我们最近开发了一个基于慢病毒的系统, 该系统携带了 DCAS9-DNMT3A 融合蛋白和 gRNA, 专门针对Snca内含子 1 (图 2a)^中的 cpg 甲基化。该协议将详细描述慢病毒载体 (LV) 的设计和生产。Lv 是提供 Crispr/cas9 成分的有效手段, 原因有几个, 即: (一) 它们携带笨重 DNA 插入物的能力, (ii) 高效地传输广泛的细胞, 包括分裂和不分割细胞³⁰和 (iii) 它们诱导最小细胞毒性和免疫原性反应的能力。最近, 我们将 LV 系统应用于具有 Snca位点的复用的患者的 hepc 衍生多巴胺能神经元, 并演示了 lv 在提供表观基因组编辑甲基化工具^方面的治疗潜力 23 (图 2 b)。事实上, Lv-grna/dnt3a 系统会导致 Snca 内ss1 区域的 DNA 甲基化显著增加。这一增加与Snca mrna 和蛋白质²³水平的降低相对应。此外, snca下调还将相关的表型恢复在snca三联/hipc 衍生的多巴胺能神经元 (例如, 线粒体 ros 的产生和细胞活力)²³。重要的是, 我们证明了 Lv-grna-dnas3a 系统在 Snca 表达中的减少能够逆转 Hipc 衍生的多巴胺能神经元的表型, 而这些表型是 hipc 衍生的多巴胺能神经元的特征。SNCA三联, 如线粒体 ros 的产生和细胞活力²³。本协议的目的是: 1) 概述用于生成高分病毒制剂的优化 LV 平台的生产和浓缩协议; 2) 描述 Hipsc 向 npc 的分化, 这些差异化模式是成熟的多巴胺能神经元^31,32 和描述的甲基化水平的目标区域内 snca 内合子1。

与最流行的载体平台, 即腺相关载体 (aav) 相比, 慢病毒平台具有主要优势, 后者是前者容纳更大的基因插入^{33、34 的}能力。Aav 的产量可以高得多, 但包装能力很低 (lt;4.8 kb), 这影响了其在提供一体机 CRISPR/Cas9 系统方面的使用。因此, 在交付 Crispr/cas9 工具所涉及的应用程序中, Lv 似乎是首选平台。因此, 这里概述的协议将是一个宝贵的工具, 研究人员希望有效地提供表观基因组编辑组件的细胞和器官。该协议进一步概述了通过修改矢量表达盒 30^、35中的元素来增加向量的生产和表达能力的策略。该战略以我们实验室开发和研究的新系统为基础, 突出了其在 10^10个病毒单位 (vu)/30,³⁵范围内产生病毒颗粒的能力。