Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения и количественной оценки уровня белка во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза путем иммуносохранения с помощью мыши черепно-лицевой ткани в качестве примеров. Кроме того, мы описываем метод приготовления и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей у молодых мышей для иммунодефицита.
Ткань иммуностоинга обеспечивает высокоспецифическое и надежное обнаружение белков, представляющих интерес в данной ткани. Здесь мы описываем полный и простой протокол для обнаружения экспрессии белка во время черепно-мозгового морфогенеза/ патогенеза с использованием мышичерепных тканей в качестве примеров. Протокол состоит из подготовки и криоотделения тканей, косвенной иммунофлуоресценции, приобретения изображения и количественной оценки. Кроме того, описан метод подготовки и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей для иммуностоинга, в качестве примеров используется черепно-мозговая ткани и длинные кости. Эти методы являются ключевыми для определения экспрессии белка и морфологических / анатомических изменений в различных тканях во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза. Они также применимы к другим тканям с соответствующими изменениями. Знание гистологии и высокое качество разделов имеют решающее значение для того, чтобы сделать научные выводы из экспериментальных результатов. Потенциальные ограничения этой методологии включают, но не ограничиваются спецификой антител и трудностями количественной оценки, которые также обсуждаются здесь.
Лицо является ключевой частью человеческой идентичности, и состоит из нескольких различных типов тканей, таких как эпителий, мышцы, кости, хрящи, зуб. Эти ткани являются производными от всех трех слоев зародыша: эктодерм, эндодерм, и мезодерм1,2. Для правильного узорства и развития черепно-мозговых тканей, пролиферации клеток, смерти и дифференциации должны быть высоко скоординированы и регулируются конкретными сигнальными путями, такими как Wnt, Fgf, Hh и Bmp пути3,4 ,5. Дефекты пролиферации, выживания или дифференциации клеток приведут к черепно-мозговым порокам развития, которые являются одними из наиболее часто встречающихся врожденных дефектов. Трансгенные мыши являются полезными инструментами дляизучения механизмов краниофациального морфогенеза и патогенеза1,2,3,4. Понимание изменений в черепно-мозговых структурах во время развития и патогенеза поможет прояснить ключевые принципы развития, а также механизмы черепно-мозговых пороковразвития1,2,3 ,4,5.
Окрашивание целых креплений или секционированных тканей с конкретными антителами является бесценным методом для определения пространственного распределения белков, представляющих интерес 6. Формально иммуностоидирование тканей может опираться либо на иммуногистохимию (IHC), либо на иммунофлуоресценцию (ИФ). По сравнению с непрозрачным продуктом реакции, генерируемым с хромогенным субстратом, таким как 3,3′-Диаминобензидин (DAB) IHC, IF включает в себя использование флуоресцентных конъюгатов, видимых флуоресценцией микроскопии. Таким образом, ЕСЛИ может четко дифференцировать положительные клетки от фонового шума, и позволяет изображения, которые будут количественно проанализированы и расширены в простой моды с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ и Adobe Photoshop7,8. Весь подход крепления окрашивания работает на небольших блоках ткани (толщиной менее 5 мм), которые могут предоставить трехмерную информацию о расположении белков/антигенов без необходимости реконструкции из разделов9,10 . Однако, по сравнению с секциями тканей, цельное иммуносирование монтирует много времени и требует больших объемов антител. Не все антитела совместимы с основным подходом всего крепления. Кроме того, неполное проникновение антител приведет к неравномерному окрашиванию или ложному отрицательному окрашиванию. Здесь мы сосредоточимся на иммунофлуоресценции обнаружения белков / антигенов на разделенных тканей. Для твердых тканей (например, головы, зуба, длинной кости), осаждение кальция во время развития / патогенез делает образец трудно сечения и легко промыть во время иммуно-денсивного лечения11,12. Большинство имеющихся в настоящее время протоколов декальцифифицировать твердые ткани перед встраиванием, чтобы сделать секционирование легче, что отнимает много времени и может уничтожить морфологию и антигены образцов, если обращаться неправильно11,12. Чтобы преодолеть проблемы, мы оптимизировали подход к криоотделению твердых тканей без декальцинации, что привело к улучшению визуализации их морфологии и распространению сигнальных белков.
Описанный здесь протокол используется для определения морфометрических и гистологических изменений в черепно-мозговых тканях трансгенных мышей БМП. В частности, протокол включает в себя (1) уборку и вскрытие тканей головы, (2) раздел и иммуностонинг экспериментальных маркеров (Ki67, pSmad1/5/9) наряду с окрашиванием TUNEL, (3) визуализацией секций с использованием флуоресцентного микроскопа и, наконец, (4) анализ и количественная оценка результатов. Протокол для подготовки и криосецификации твердых тканей без декальцинации также описано13. Эти методы оптимизированы для черепно-мозговых тканей. Они также применимы к другим тканям разного возраста образцов с соответствующими модификациями.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для подготовки головы мыши и недекальцифицированных костных тканей, а также криосекции для иммуносточки зрения клеточной пролиферации, клеточной смерти и сигнальных маркеров БМП. Мы также подробно описываем стратегию получения количественн…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01DE020843 до Y.M.), Международной ассоциацией ФОП (Y.M.), а также грантом от Национального фонда естественных наук Китая (31500788 до J.Y.).
Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Tris | Sigma | 10708976001 |