合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates
Summary
このプロトコルではポッド、phenyoxadiazolyl メチル スルホンに基づく生体分子、特に抗体のチオールに貨物のサイト選択的添付試薬の合成について述べる。また、合成とポッド ベアリング二官能性キレート剤とその活用モデル抗体の特性を説明します。
Abstract
マレイミド ベアリング二官能性プローブは、生体分子、特に抗体のチオール化合物の選択的変更のため何十年も採用されています。まだ染色によるチオエーテルのリンケージは、レトロなマイケル反応を受けることができるので、マレイミド基の抱合体は体内の限られた安定性を表示します。、これはもちろん、放射性ペイロードまたは循環のチオール軸受生体分子との交換のリリースにつながることができます。これらのプロセスの両方だけでなく、健康な臓器で高い放射能濃度を作り出すことができる活動の画像コントラストを減少させると低い治療率の結果、ターゲット組織内濃度を減少します。2018 年に我々 はモジュラー、安定して、簡単にアクセスできる phenyloxadiazolyl メチル スルフォン剤の作成を報告した-‘ポッド’ と呼ばれる — チオール ベースの bioconjugations のためのプラットフォームとして。サイト選択的 bioconjugations のポッド ベースが均質な明確で高い陽性と非常に安定した radioimmunoconjugates に再現性をもって、堅牢に作成することが明らか。さらに、臨床実験大腸癌のマウスモデルではこれらはサイト選択的に、マレイミド基により合成された放射性標識抗体と比較して展示はるかに優れた生体内でパフォーマンスに radioimmunoconjugates をラベルを示しています。動詞。このプロトコルではポッド、ユビキタスのキレート剤 DOTA (ポッド DOTA) の二官能性鞘軸受バリアントと HER2 標的抗体トラスツズマブにポッド DOTA の活用の創造の 4 つのステップの合成について述べる。
Introduction
放射性医薬品化学者長い選択性と両方の核のイメージングのための疾患のバイオ マーカー抗体の特異性を悪用して放射線療法1を対象としました。抗体のカイネティックスにはるかに最も一般的なアプローチはアミノ酸に radiolabeled 補欠分子族または radiometal のキレート剤の無差別な添付ファイルを前提と-最もよくリシン-免疫グロブリン (の構造の中図 1 a)2。この戦略は、確かに有効ですが、そのランダムなサイト固有の性質は、問題を作成できます。具体的には、伝統的な化反応アプローチを作り出す不十分な定義し、異種 immunoconjugates 何千もの生物学的および薬理学的特性3の独自のセットを持つ別の位置の混合物から成る。さらに、貨物を抗体の抗原結合ドメインに追加する場合、ランダム化反応の抗体の免疫反応性が低下します。
年これらの問題4,5を対処するためにさまざまな部位特異的、選択的化反応戦略が開発されてきました。これらの方法の最も一般的なマレイミド軸受プローブ (図 1 b) システインのスルフヒの結紮に依存します。IgG1 抗体には自然 4 鎖間ジスルフィド、染色によるチオエーテル結合を形成するマレイミドとマイケル付加反応を受けることができる無料のチオールを生成する選択的に還元することができますリンクが含まれます。チオールおよびマレイミド類の使用は確かに伝統的な方法は、以上の改善とさまざまなマレイミド軸受シントンと二官能性キレート剤が使用可能。ただし、この方法論にも深刻な制限があることに注意してくださいすることが重要です。マレイミド基 immunoconjugates 限られた安定性生体を展示は、チオエーテル リンケージがレトロなマイケル反応 (図 2)6,7,8,9,を受けることができるので10です。 これは、もちろん、放射性のペイロードまたは循環 (例えば、グルタチオン、アルブミン) のチオール軸受生体との交換のリリースにつながることができます。これらのプロセスの両方は、正常臓器の放射能濃度を増加、ターゲット組織、画像コントラストを減少させると低い治療率の結果で放射能濃度を減少できます。Tosylates、ブロモおよびヨード-アセチル ビニールについて検討11,12,13,など、これらの問題を回避するためにいくつかの代替チオール反応試薬が開発されています。14,15,16,17します。 ただし、これらの方法すべては広範な応用を妨げている制限があります。
約 5 年前、後半のカルロス ・用いる III スクリップス研究所の研究室は、非常に安定した連携 (図 1 と図 3) のチオール基の選択的形成用試薬として phenyloxadiazolyl メチルについて検討の使用を開拓18,19. 著者採用無料のシステインを含むために設計されたいくつかの抗体を変更するフルオレセインの phenyloxadiazolyl メチル スルフォン軸受バリアント最終的に類似しているより安定して immunoconjugates を生産マレイミド基のプローブを使用して作成された構造。この有望な仕事を見て、この技術を放射化学でやっとのことでのみ使用されていたがまだ使用されていないすべての二官能性キレート剤または radioimmunoconjugates20,21の合成に、多少びっくりしました.アプリケーション、ただし、この不足はすぐにより多くの意味を作り始めた: シグマ アルドリッチから試薬の調達でいくつかの試みと分解物の複雑な混合物の領収書で起因した < 目的化合物の 15%。さらに、自分自身で報告されている試薬を合成現実的なオプションでもなかった、公開された合成ルートは面倒です高度な有機化学の機器が必要とするほとんどの放射化学、分子イメージング研究所-我々 を含む、単に持っていません。
これらの障害に対し、簡単にアクセスできますを作成し、安定した堅牢かつ合理的に安易な合成経路を介して取得することができます phenyloxadiazolyl メチル スルフォン試薬に着手しました。今年、我々 はモジュラー、安定して、簡単にアクセスできる phenyloxadiazolyl メチル スルフォン剤の作成を報告した-‘ポッド’ と呼ばれる — チオール ベース bioconjugations (図 1 と図 3)22のためのプラットフォームとして。ポッドと試薬の主な違いは、用いる、によって報告されたらは前者、後者は同じ位置 (図 4) フェノール設備 phenyloxadiazolyl メチル スルホン基に接続されているアニリン リングを採用します。この変更より簡単かつアクセス可能な合成ルートを容易と同様、市販化合物と私たちの経験が象徴的な場合-より安定した最終的な試薬。この作品もポッド ベアリング二官能性キレート剤のペアが合成。-ポッド DFO とポッド CHX A ”-DTPA — それぞれ89Zr- 177Lu ラベル radioimmunoconjugates の作成を容易にします。説明するようサイト選択的 bioconjugations のポッド ベースが均質な明確で高い陽性と非常に安定した radioimmunoconjugates に再現性をもって、堅牢に作成することを確認しました。さらに、大腸癌のマウスモデルでの臨床実験はこれらサイト選択的にラベルが付いている radioimmunoconjugates 展示マレイミド基により合成された放射性標識抗体と比較して優れた体内のパフォーマンスを示しています。動詞。
この作品のアーチの目標明確に定義された、均一な非常に安定した、高度陽性 immunoconjugates in vitro および in vivo のアプリケーションの作成を容易にすることです。合成のアプローチはシンプルなほぼすべての研究室では、実行して別のキレート剤、蛍光物質、または貨物の茄多で親ポッド試薬を変更できます。このプロトコルとそれに伴うビデオ、ポッド (図 5) の簡単な 4 つのステップの合成について述べるDOTA、 64Cu の調整、 68Ga、 111、 177Lu 225Ac (図 6) に広く使われているキレート剤のポッド軸受けバリアントの作成さや DOTA のモデル抗体陽性、HER2 標的特異的な IgG1 トラスツズマブ (図 7) に化反応。
Protocol
Representative Results
Discussion
本報告で我々 は radiolabeling や生体内で実験の任意のプロトコルを含むことができない分野します。理由は、簡単です。前者に関してポッド ベース ・免疫のカイネティックス違いはありませんまったく他化反応戦略を使用して合成・に免疫のと手順が総合的にされている他の2 の見直し.後者に関して、臨床生体実験 (すなわち、マウスモデル、用量等) の具体的なアプリケー…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は博士サイ キラン シャルマの役に立つ会話をありがちましょう。
Materials
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
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