סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

כימאים radiopharmaceutical זמן לנצל את סלקטיביות וספציפיות של נוגדנים עבור סמנים ביולוגיים של המחלה עבור שניהם הדמיה גרעינית, ממוקד הקרנות¹. הגישה הנפוצה רחוק ביותר radiolabeling של נוגדנים המרקסיסטי מבוסס על הקובץ המצורף ללא הבחנה של קבוצות prosthetic radiolabeled או radiometal chelators כדי חומצות אמינו – לרוב lysines — בתוך המבנה של אימונוגלובולינים ( איור 1A)². אסטרטגיה זו הוא יעיל בהחלט, טבעה אקראיות, לא אתר-ספציפית ניתן ליצור בעיות. באופן ספציפי, גישות מסורתיות bioconjugation מייצרים מוגדרת היטב, immunoconjugates הטרוגנית המורכבת תערובות של אלפי regioisomers שונים, כל אחד עם ערכה ייחודית של תכונות ביולוגיות תרופתי³. יתר על כן, bioconjugation אקראיים לטרפד את immunoreactivity של נוגדנים אם המטען מצורף לתחומים של נוגדן-אנטיגן מחייב.

במהלך השנים פותחו מגוון רחב של אסטרטגיות ספציפיות-לאתר, האתר-סלקטיבי bioconjugation כדי לטפל אלה בעיות^4,5. הנפוצה ביותר של גישות אלה מסתמך על מצדו של הגששים maleimide מניבי לקבוצות sulfhydryl של cysteines (איור 1B). IgG1 נוגדנים באופן טבעי מכיל 4 דיסולפידי בין שרשרת גשרים, קישורים כי ניתן להפחית באופן סלקטיבי להניב מסוגל שעברו מייקל תגובות תוספת עם maleimides כדי ליצור קשרים thioether succinimidyl חינם תיולים. השימוש תיולים maleimides הוא בהחלט שיפור לעומת שיטות מסורתיות, מגוון רחב של נושאי maleimide synthons, bifunctional chelators זמינים כעת. עם זאת, חשוב לציין כי מתודולוגיה זו יש מגבלות רציניות גם כן. Immunoconjugates מבוססי Maleimide שהפגינו ויוו מוגבל יציבות כי הצמדה thioether יכולות לעבור. מייקל רטרו התגובה (איור 2)^{6,7,8,9, 10}. זה, כמובן, יכול להוביל לשחרור המטען רדיואקטיבי או exchange שלו עם מולקולות תיול מניבי במחזור (למשל, גלוטתיון או אלבומין). שני התהליכים הללו יכולים להגדיל את ריכוז פעילות באיברים בריאים וכן להקטין ריכוז פעילות ברקמות היעד, וכתוצאה מכך ניגודיות הדמיה מופחתת יחסי טיפולית נמוכה יותר. מספר חלופי ריאגנטים תיול-תגובתי פותחו במטרה לעקוף סוגיות אלה, כולל tosylates, ברומו – ו iodo-acetyls, ויניל sulfones^{11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17}. עם זאת, כל הגישות האלה יש מגבלות יש הקשו את היישום הנרחב שלהם.

לפני כחמש שנים במעבדה של המנוח קרלוס השלישי Barbas במכון המחקר סקריפס חלוץ השימוש phenyloxadiazolyl מתיל sulfones כמו ריאגנטים עבור היווצרות סלקטיבי של קישורים יציב מאוד עם תיולים (1C איור, איור 3) ^{18 , 19}. המחברים המועסקים וריאציה sulfone מניבי מתיל phenyloxadiazolyl של fluorescein כדי לשנות את מספר נוגדנים מתוכנן להכיל שאריות ציסטאין חינם, בסופו של דבר לייצר immunoconjugates עם יציבות גבוהה יותר מאשר מקביל בונה שנוצרו באמצעות הגששים מבוסס maleimide. רואה את זה מבטיח, היינו מופתעת כי טכנולוגיה זו היה בשימוש רק בקושי ב radiochemistry, היה לא עדיין בשימוש בכלל בסינתזה של bifunctional chelators או^20,radioimmunoconjugates²¹ . זה מחסור של יישומים, אולם עד מהרה החלו הגיוני יותר: מספר נסיונות ברכישת הכימית של סיגמה-אולדריץ הביא הקבלה של תערובות מורכבים של השפלה מוצרים עם < 15% משטח המתחם הרצוי. בנוסף, סינתזה הכימית דווח על עצמנו לא היה אופציה ריאלית, כפי המסלול סינתטי שפורסם הוא קצת מסורבל ודורש ציוד מתוחכם כימיה אורגנית זה רוב radiochemistry והדמיה מולקולרית מעבדות — לרבות שלנו – פשוט לא ניחנת.

בתגובה מכשולים אלה, יצאנו כדי ליצור נגישה בקלות ויציבה מאוד ריאגנט sulfone מתיל phenyloxadiazolyl שניתן להשיג באמצעות מסלול סינטטי למדי נתיישב ועמיד. מוקדם יותר השנה, דיווחנו הבריאה של קרונות, יציב ו- phenyloxadiazolyl נגיש בקלות מתיל sulfone ריאגנט – המכונה “תרמילים” — כפלטפורמה מבוססי תיול bioconjugations (1C איור, איור 3)²². ההבדל העיקרי בין התרמילים הכימית שדווחו על-ידי Barbas, et al. הוא לשעבר מעסיקה טבעת אנילין המצורפת את moiety sulfone מתיל phenyloxadiazolyl, בזמן האחרון כולל של פנול באותה תנוחה (איור 4). שינוי זה מקלה על מסלול סינטטי פשוטה ונגישה יותר וכן — אם הניסיון שלנו עם המתחם זמינים מסחרית הוא סמלי – ריאגנט הסופי יותר יציב. בעבודה זו, אנחנו גם מסונתז זוג תרמילי מניבי chelators bifunctional — תרמילי-DFO ואת התרמילים-CHX-A ‘-DTPA — כדי להקל על היצירה של ⁸⁹Zr – ¹⁷⁷התווית על-ידי Lu radioimmunoconjugates, בהתאמה. כפי שנדון, הראו כי מבוססי תרמילי bioconjugations האתר סלקטיבית reproducibly ו- robustly ליצור radioimmunoconjugates הומוגנית, מוגדרים היטב, immunoreactive מאוד, יציבה מאוד. יתר על כן, ניסויים פרה במודלים מאתר של סרטן המעי הגס הראו כי אלה באתר באופן סלקטיבי הנקרא radioimmunoconjugates התערוכה ביצועים מעולים ויוו בהשוואה radiolabeled נוגדנים מסונתז via מבוסס maleimide ההטיות.

מטרת עבודה זו מתקשת יתר היא להקל על יצירת immunoconjugates מוגדרים היטב, הומוגנית, יציבה מאוד, immunoreactive מאוד ליישומים במבחנה ויוו. הגישה סינתטית היא פשוט מספיק כדי לבצע כמעט כל במעבדה, הכימית תרמילי האב יכול להיות שונה עם שפע של chelators שונים, fluorophores או מטענים. פרוטוקול זה, הסרטון הנלווה, נתאר את הסינתזה פשוט בן ארבעה שלבים של תרמילי (איור 5); היצירה של variant תרמילי מניבי של DOTA, chelator בשימוש נרחב עבור תיאום של ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ¹¹¹ב, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac (איור 6); את bioconjugation של תרמילי-DOTA נוגדן מודל, הרצפטין IgG1 פילוח HER2 (איור 7).