אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

Cytometry זרימה היא טכניקה שפותחה כדי לנתח פרמטרים מרובים על חלקיקי יחיד בשיעור של אלפי אירועים לכל השני¹. דוגמאות של דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה כוללים, אך אינם מוגבלים, תאים, חרוזים, חיידקים, שלפוחית, כרומוזומים. מערכת fluidic מנחה את החלקיקים בשלב החקירה שבו כל חלקיק חותך הנתיב שלו עם לייזרים אחד או יותר, פרמטרים מרובים נרשמים לצורך ניתוח נוסף. קדימה ואת הצד בסורקים, שנוצר על ידי פיזור של האור לייזר טהור, משמשים כדי לזהות אוכלוסית היעד ולאחזר מידע על גודלו היחסי פנימיות מורכבות צפיפות החלקיקים, בהתאמה. כל הפרמטרים האחרים, זה חשבון עבור רוב הנתונים בניתוח cytometric זרימה, נגזרים על ידי הגששים התווית על-ידי fluorochrome מזהה, לאגד מטרות ספציפיות על החלקיקים עניין.

Cytometry זרימה הוא כלי ראשי ללימודי אימונולוגי לזהות ולאפיין אוכלוסיות תאים. לנתח את המורכבות של מערכת החיסון, לוחות ססגוניות מתפתחים כל הזמן כדי להרחיב את מספר סמנים שנרשם בו-זמנית עבור immunophenotyping עמוק של אוכלוסיות תא¹. זה מוביל להתפתחות של fluorochromes, והכלים כשרוני עם האחרונים cytometers זרימה באיכות גבוהה העולה על 20 פרמטרים פלורסנט. התוצאה היא תכנון המחקר מורכבים בשל חפיפה ספקטרלי fluorochrome, עלויות גבוהות יותר הקשורים עם מפעילי labelling ומיומנים נוגדנים מותאמים אישית. במספר מקרים, מורכבות ועלויות מופחתים באמצעות לוחות נפרדים של סמנים עבור אוכלוסיות תאים שונים. גישה זו, עם זאת, מועדת לשגיאות, מפחית את המידע בחלונית כל אחד, יכול להיות קשה להחיל על דגימות עם מספר מצומצם של תאים. יתר על כן, הגדלת מספר סמנים מונע עמוק immunophenotyping על מכשירים עם פרמטרים פלורסנט פחות. קודם לכן פיתחנו פרוטוקול מכתימים לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4⁺ ו CD8⁺ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בתוך תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות רק שני fluorochromes במקום ה-7 הנדרש באמצעות המסורתי “סמן אחד fluorochrome אחד” הגישה (www.hcdm.org)^2,3. הדו ח הראשוני שלנו חקר ואומת הרעיון של שילוב סמני שבע שני fluorochromes עבור immunophenotyping עמוק. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול צעד צעד-מאת לבודד, כתם כדוריות דם היקפיים, התמקדות בהיבט המעשי ופתרון צעדים כדי להשיג מכתים מוצלחת.

פרוטוקול זה מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני יש ביטוי קבוע על פני התא, כי האוכלוסייה בכל תא יש שילוב בלעדי של שושלת היוחסין סמנים. ב- PBMCs, ביטוי CD3 subdivides תאים חיסוניים לשתי קטגוריות עיקריות: CD3-חיובי T לימפוציטים ותאי CD3-שלילי. בתוך קבוצת חיובית CD3, CD4⁺, CD8⁺ γδ T תאים יכולים להיות מופרדים באמצעות נוגדנים המיועדים אך ורק CD4, CD8, הקולטן γδ. באופן דומה, בתוך קבוצת שלילי CD3, בתאי B, תאי NK, ומונוציטים יכול להיות ייחודי מזוהה באמצעות נוגדנים נגד CD19, CD56 ו- CD14, בהתאמה. בגישה fluorochrome-אחד סמן סטנדרטי אחד, נגד-CD3,-CD4,-CD8, – CD14,-CD19, – CD56 ו- TCR נוגדנים γδ מזוהים עם שבעה fluorochromes שונים. הגישה שלנו משלבת אנטי CD3-CD56, ו- – TCR נוגדנים γδ אחד fluorochrome (הנקראת עבור נוחות fluorochrome A), אנטי-CD4,-CD8, – CD14 ו- CD19 נוגדנים בבית fluorochrome שונים (fluorochrome B). הדבר אפשרי ע י שילוב של נוגדן טיטור וביטוי אנטיגן דיפרנציאלית. CD4 בשני⁺ ו CD8⁺ T תאים הן חיוביות עבור נוגדן anti-CD3 ב- fluorochrome A, אבל הם יכולים להיות מופרדים ב- fluorochrome B למקסם את הביטוי של האות CD8 תוך הצבת, עם טיטור אד הוק, האות CD4 בין CD8, התאים חיובי-CD4/CD8 כפול שלילי CD3. תאי T γδ מבטא רמה גבוהה יותר של CD3 מאשר CD4 ו CD8, ולכן הם יכולים להיות מזוהה CD3 גבוהה⁴. האות הזה הוא מועלה על ידי תיוג γδ תאי T ב- fluorochrome A עם נוגדנים γδ anti-TCR, ובכך לשפר את ההפרדה בין תאי T נמוך CD3 CD3 גבוהה γδ T תאים. בתאי B יכול להיות מזוהה CD3^– ב fluorochrome A ו- CD19⁺ ב- fluorochrome B. כדי להפריד CD3 שליליים תאי NK מתאי B, נוגדן anti-CD56 שימש ב- fluorochrome A האנטי-CD3. דבר זה אפשרי משום CD56 הביע על תאי NK ברמה נמוכה יותר מאשר CD3 על תאי T⁵. לבסוף, ומונוציטים ניתן לזהות באמצעות שילוב של מאפיינים לפנים לצד פיזור וביטוי של CD14 ב- fluorochrome B.

הרעיון של שילוב עד ארבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes יש ניסיון כבר בהצלחה לפני^6,7,8, נעשה שימוש ב פרוטוקול קליני כדי לזהות אוכלוסיות לימפוציטית ממאיר⁹ . הדוח הקודם גם משולב 7 סמנים (עם ירידה לפרטים שונים של הסמנים פעם בפרוטוקול שלנו) באמצעות שתי fluorochromes, אך גישה זו התבססה על תוויות מתחם של כל נוגדן עם כמות משתנה של fluorochrome¹⁰. זהו לעומת השיטה שלנו, אשר משתמשת נוגדנים זמינים מסחרית, ניתן להתאים את תצורת המכשיר והוא יכול לנצל הדור החדש של פולימר fluorochromes.

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להרחיב את הגבולות אופטי של רוב cytometers זרימה המאפשר ההקלטה של חמישה סמנים נוספים לחקור אוכלוסיות תאים מורכבים. כתוצאה מכך, ניתן לבצע ניתוח אימונולוגי מתקדמים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, 2-3 fluorochrome שדה מכשירים ניתן להשיג תוצאות יוצא דופן באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה כדי ליצור זרימה מודולרי cytometric לוחות מיקוד מספר שושלות באותו הזמן¹¹. זה יכול באופן פוטנציאלי להפחית את מספר לוחות המשמשים cytometry זרימה immunophenotyping מודולרית, להפחית עלויות, שגיאות זמן טיפול. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.