双氟铬流式细胞仪对七种免疫细胞子集的判别

流式细胞术是一种以每秒几千个事件1的速率分析单个粒子上的多个参数的技术.流式细胞仪分析的标本包括但不限于细胞、珠子、细菌、囊泡和染色体。流体系统在审讯点引导粒子, 在那里, 每个粒子与一个或多个激光相交其路径, 并记录多个参数进行进一步分析。利用纯激光散射产生的正向散射和侧散射分别用于识别目标群体并检索有关粒子相对大小和内部复合度的信息。所有其他参数, 这些参数占流式细胞仪分析中的大部分数据, 都是由荧光色标记的探针得出的, 这些探头识别并绑定到感兴趣粒子上的特定目标。

流式细胞术是免疫学研究的主要工具, 用于识别和表征细胞群。为了剖析免疫系统的复杂性, 多色面板不断进化, 以扩大同时记录的标记数量, 用于细胞群的深度免疫表型 1.这导致了更有能力的仪器和荧光素的开发, 最近的高端流式细胞仪超过20个荧光参数。这导致了复杂的研究设计, 由于氟铬光谱重叠, 并在更高的成本与定制抗体标签和熟练的操作人员。在某些情况下, 通过对不同的细胞群使用单独的标记面板, 可以降低复杂性和成本。但是, 这种方法容易出错, 会减少每个面板中的信息, 并且可能很难应用于单元格数量有限的示例。此外, 由于标记数量的增加, 在荧光参数较少的仪器上进行了深度免疫表型。我们之前开发了一个染色协议, 以确定主要的人类免疫群体 (cd4⁺和 cd8^{+ t 细胞}, γ t 细胞, b 细胞, nk 细胞和单核细胞) 结合使用的七个谱系标记只有两个含氟铬, 而不是使用传统的 “一-一标记” 方法 (www.hcdm.org)^2,3所需的七个。我们的初步报告探讨并验证了将七个标记组合在两个荧光素中用于深免疫表型的概念。在本报告中, 我们提出了一个逐步分离和染色外周血细胞的协议, 重点介绍了实际方面和故障排除步骤, 以实现成功的染色。

该协议基于这样的观察, 即谱系标记在细胞表面有一个恒定的表达式, 并且每个细胞群都有一个排他的谱系标记组合。在 pbmc 中, cd3 表达将免疫细胞细分为两大类: cd3 阳性 t 淋巴细胞和 cd3 阴性细胞。在 cd3 阳性亚群中, cd4⁺、cd8⁺和γ t 细胞可以使用仅针对 cd4、cd8 和γ受体的抗体分离。以类似的方式, 在 cd3 阴性亚群中, b 细胞、nk 细胞和单核细胞可以分别使用抗 cd19、cd56 和 cd14 的抗体进行唯一的鉴定。在标准的一荧光色标记方法中, 用七种不同的荧光色检测到抗 cd3、-cd4、-cd8、-cd14、-cd19、-cd56 和-tcr γ抗体。我们的方法将抗 cd3、-cd56 和-tcr γ抗体结合在一个荧光素 (标记为方便氟铬 a) 和抗 cd4、cd8、-cd14 和-cd19 抗体中的不同氟铬 (氟铬 b) 中。这是可能的抗体滴定和差异抗原表达的组合。cd4⁺和 cd8^{+ t 细胞}对氟铬 a 中的抗 cd3 抗体呈阳性, 但它们可以在荧光 b 中分离, 最大限度地提高 cd8 信号的表达, 同时在 cd8 和 cd8 之间放置 cd4 信号。正 cd3 正 cd–cd8 双负细胞。与 cd4 和 cd8 相比, γ t 细胞的 cd3 表达水平更高, 因此可以识别为 cd3 高⁴。通过在荧光 a 中标记带有抗 tcr γ抗体的 h2 t 细胞, 进一步增强了这一信号, 从而改善了 cd3 低 t 细胞与 cd3 高γ t 细胞之间的分离。b 细胞可以被识别为 cd3^–在荧光铬 a 和 cd19⁺在荧光铬 b。为了将 cd3 阴性 nk 细胞与 b 细胞分离, 在氟铬 a 中使用了抗 cd56 抗体作为抗 cd3 抗体。这是可能的, 因为 cd56 在 nk 细胞上的表达水平远远低于 t 细胞⁵上的 cd3。最后, 单核细胞可以通过向前散射特性和 cd14 在氟铬 b 中的表达的组合来识别。

在^6、7、8之前, 已经成功地尝试了使用两种荧光素组合四个标记的想法, 并在临床协议中使用了这一想法, 以确定恶性淋巴细胞群 9.以前的一份报告还使用了两个荧光色素 (与我们的协议中使用的标记不同的特异性), 但这种方法依赖于对每个抗体进行复杂的标记, 其中的荧光铬^量不同。这与我们使用市售抗体的方法形成鲜明对比, 该方法可根据仪器配置进行调整, 并可利用新一代聚合物荧光色。

这种方法的总体目标是扩大大多数流式细胞仪的光学极限, 允许记录五个额外的标记, 以询问复杂的细胞群。因此, 先进的免疫分析可以在经济实惠的6-10 氟铬流式细胞仪上进行, 2-3 个氟铬现场仪器可以在资源有限的领域取得显著成果。高端仪器也可以受益于这种方法, 通过使用额外的荧光色, 以完成更深入的流式细胞仪分析, 并创建模块化流式细胞仪面板, 同时^针对多个血统11。这可能会减少模块化免疫表型流式细胞术中使用的面板数量, 并减少成本、错误和处理时间。这种方法也非常适用于细胞数量有限的临床样本。