Summary

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Hier präsentieren wir eine elegante Protokoll für in Vivo Evaluierung der Impfstoff Wirksamkeit und Host Immunantworten. Dieses Protokoll kann für Impfstoff-Modelle, die studieren, virale, bakterielle oder parasitäre Erreger angepasst werden.

Abstract

Impfstoffe sind ein 20th Jahrhundert medizinische Wunder. Sie haben drastisch reduziert die Morbidität und Mortalität durch Infektionskrankheiten verursacht und trugen zu einem markanten Anstieg der Lebenserwartung rund um den Globus. Bestimmung der Impfstoffwirksamkeit bleibt jedoch eine Herausforderung. Anzeichen dafür deutet darauf hin, dass die aktuelle azelluläre Impfstoff (aPV) für Bordetella Pertussis (B. Pertussis) suboptimal Immunität induziert. Daher ist eine große Herausforderung einen nächsten Generation Impfstoff entwerfen, der schützende Immunität ohne die negativen Nebenwirkungen von einer ganzen Zelle Impfstoff (wPV) induziert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das wir verwendet, um die Wirksamkeit von vielversprechenden, neuartigen Adjuvans zu testen, die verzerrt Immunantworten auf einen schützenden Th1/Th17-Phänotyp und fördert eine bessere Clearance von B. Pertussis Herausforderung aus murinen Atemwege. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für Maus-Immunisierung, bakterielle Inokulation, Gewebe zu ernten und Analyse von Immunreaktionen. Mit dieser Methode, innerhalb unseres Modells haben wir entscheidende Mechanismen ausgelöst durch eine vielversprechende, nächste Generation azellulären Pertussis-Impfstoff erfolgreich aufgeklärt. Diese Methode kann auf jede Infektionskrankheit Modell angewendet werden, um Impfstoffwirksamkeit zu bestimmen.

Introduction

Impfstoffe sind eines der größten öffentlichen Gesundheit Errungenschaften des 20. Jahrhunderts, doch wir immer noch nicht vollständig verstehen die Mechanismen, durch die erfolgreiche Impfstoffe schützende Immunität anregen. Die Identifizierung von molekularen Signaturen (zB., Zelle Aktivierungsmarker, Erweiterung der zellulären Subtypen und Muster der Genexpression) induziert nach der Impfung bietet eine Fülle von Informationen für die Vorhersage und erzeugen eine wirksame Immunantwort. Die Komplexität der Wirt-Pathogen-Antworten kann nicht angemessen mit in-vitro- Zelle Kultur Systeme1repliziert werden. In Vivo Impfstoff Modelle sind entworfen, um damit auch mehrere Immunzelle Arten innerhalb des Hosts zu bewerten. Dies bietet einen Vorteil, wenn Impfstoff Antigen Verarbeitung und Präsentation, differenzielle Zytokin-Sekretion und Ausbau der Immunzellen zu charakterisieren. Das hier beschriebene Protokoll sieht eine detaillierte Methode zum Bestimmen der Impfstoffwirksamkeit durch Auswertung der systemische und lokale Immunantwort und Quantifizierung der Erreger Belastung in Geweben von Interesse. Das hier angegebene Beispiel testet die Wirksamkeit von einer experimentellen Impfstoff gegen den Erreger Bordetella Pertussis (B. Pertussis).

B. Pertussis ist ein gramnegatives Bakterium, das die ätiologische Agent der Erkrankung der Atemwege Husten Keuchhusten (Pertussis)2,3ist. Engen Kontakt mit infizierten Personen (symptomatisch oder asymptomatisch) führt zur Übertragung, Kolonisierung und Krankheit. Trotz erheblichen globalen Impfstoff Abdeckung4Keuchhusten gilt eine aufrappelte Krankheit in vielen Ländern auf der ganzen Welt und ist die Hauptursache für vermeidbare Kindheit Todesfälle5,6,7, 8. 2015, B. Pertussis und der Pertussis wurden in das National Institute of Allergy und infectious Diseases (NIAID) emerging Pathogen/Infektionskrankheiten Liste, unter Betonung der Notwendigkeit für die Entwicklung besserer Impfstoffe zur Verfügung stehen, das verleiht langlebige schützende Immunität.

Derzeit ist ein aktives Gebiet der Untersuchung, Pertussis Wiederaufleben Steuern Entwicklung von einer nächsten Generation azellulären Pertussis-Impfstoff (aPV) mit einer optimalen Kombination von neuartige Adjuvantien und Antigenen, die Immunantwort ausgelöst durch die ganze Zelle zu imitieren Pertussis-Impfstoff (wPV)9. Mit dem Protokoll beschrieben, berichtet wir kürzlich, dass die Änderung von einer aktuellen FDA-zugelassene aPV durch die Zugabe von ein neuartiges Adjuvans Bordetella Kolonisation Faktor A (BcfA), führte eine effizientere Reduzierung von B. Pertussis Keimbelastung von Maus Lunge10,11. Diese erhöhte Schutz wurde durch die Schiefstellung einer Alaun-induzierte Th1/Th2-Immunantwort, die schonender Th1/Th17 immun Profil10begleitet. Dieses Protokoll ist detailliert und umfassend, die Ermittler maximale Informationen durch gleichzeitige Auswertung von Host und immunen Antworten zu einer Vielzahl von Krankheitserregern zu ermöglichen.

Das hier beschriebene Protokoll folgt der repräsentativen Impfstoff Zeitplan, in Abbildung 1gezeigt, um optimale Host Immunantworten zu gewährleisten.

Protocol

Alle Experimente mit lebenden Tieren wurden nach ein Protokoll genehmigt von der Ohio State University IACUC nach IACUC-Richtlinien durchgeführt. C57BL/6 Mäusen wurden in alle Impfungen und Infektionen eingesetzt. Sowohl weibliche als auch männliche Mäuse sind in jeder Gruppe nach NIH-Richtlinien verwendet. Die Anzahl der Tiere pro Gruppe wurde durch macht Berechnungen auf Grundlage der prognostizierten unterschiedlichen Ausgang unter experimentellen Gruppen bestimmt. Beispielsweise ergibt 8 Mäuse pro Gruppe 80 % Le…

Representative Results

Das Modell beschrieben zeigt eine Methode zur Bewertung von Impfstoff Effizienz und Immunreaktionen während Wirt-Pathogen Interaktionen. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Impfstoff Zeitplan zu immunisieren und Mäuse zu infizieren und zu ernten Gewebe für die Analyse verwendet. Abbildung 2 zeigt das Setup des Systems, Anästhesie, Mäuse, induzieren Ermittler Impfungen und bakterielle Befallsdruck zu ermöglichen. <strong c…

Discussion

Das umfassende Protokoll hier beschriebenen um Impfstoff induzierte Immunität gegen B. Pertussis -Infektion zu studieren wird auch Bewertung der Host Antworten auf eine Vielzahl von anderen Krankheitserregern ermöglichen. Das Protokoll beschreibt Methoden liefern Impfungen, bestimmen Impfstoff Wirksamkeit folgende Erreger Herausforderung und parallele Dissektion der Immunfunktion. Bei der Anpassung des Protokolls um andere Krankheitserreger zu studieren, müssten mehrere Parameter geändert werden. Diese beinh…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von 1R01AI125560-01 und Start-up-Fonds von der Ohio State University unterstützt.

Materials

2L induction chamber Vet Equip 941444
Fluriso Vet One V1 501017 any brand is appropriate
Bordet Gengou Agar Base BD bioscience 248200
Casein Sigma C-7078
Casamino acids VWR J851-500G Strainer Scholte (SS) media components
L-Glutamic acid Research Products Int G36020-500
L-Proline Research Products Int P50200-500
Sodium Chloride Fisher BP358-10
Potassium Phosphate monobasic Fisher BP362-1
Potassium Chloride Fisher P217-500
Magnesium Chloride hexahydrate Fisher M2670-500G
Calcium Chloride Fisher C75-500
Tris base Fisher BP153-1
L-cysteine HCl Fisher BP376-100 SS media suplements
Ferrous Sulfate heptahydrate Sigma F-7002
Niacin Research Products Int N20080-100
Glutathione Research Products Int G22010-25
Ascorbic acid Research Products Int A50040-500
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 11875093
FBS Sigma F2442-500mL  any US source, non-heat inactivated
gentamicin ThermoFisher Scientific 15710064
B-mercaptoethanol Fisher  BP176-100
15mL dounce tissue grinder Wheaton 357544 any similar brand is appropriate
Cordless Hand Homogenizer Kontes/Sigma  Z359971-1EA any similar brand is appropriate
Instruments – scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders any brand is appropriate
3mL syringes BD bioscience 309657
15mL conical tubes Fisher  339651
1.5mL microfuge tubes Denville C2170
70um cell strainers Fisher  22363548
60mm plates ThermoFisher Scientific 130181
48-well tissue culture plates ThermoFisher Scientific 08-772-1C
1mL insulin syringe 28G1/2 Fisher Scientific/Excel Int. 14-841-31
Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-173-21
Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-173-77
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-172-09

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Caution, K., Yount, K., Deora, R., Dubey, P. Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice. J. Vis. Exp. (144), e58930, doi:10.3791/58930 (2019).

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