Analyse de cisaillement induite par le flux de Migration des cellules B Zone marginale murin In Vitro

Les cellules immunitaires sont les cellules les plus mobiles dans le corps humain et doivent souvent composer avec la force de cisaillement de la circulation sanguine et lymphatique. Cependant, il y a relativement peu d’études sur les migrations induite par la force de cisaillement de leucocytes^1,2,3,4,5. Nous présentons ici un protocole fiable et quantitatif pour analyser la réponse d’une cellule immunitaire au flux in vitro. Réalisation de l’essai ne requiert pas de fabrication de composants, et tous les équipements et les consommables sont disponibles dans le commerce. Le protocole, y compris l’analyse de purification et de la migration cellulaire, peut être effectué en une seule journée. Enfin, bien que nous décrivons la migration des cellules de B de la zone marginale (MZBs), le protocole peut être adapté pour analyser des migrations contre flux d’autres types de cellules immunitaires. Il est donc possible d’utiliser ce test pour analyser systématiquement un large éventail des leucocytes avec un panel exhaustif des conditions.

MZBs sont une population de cellules de B qui, chez la souris, se trouvent uniquement dans la rate et la navette entre l’intérieur des follicules et les zones marginales^6,7,8,9. La zone marginale est une couche de cellules immunitaires environ 5 à 10 cellules épais. La couche de cellules enveloppe du follicule et compose principalement de MZBs et macrophages mais également les cellules T (iNKT) tueuses naturels invariants, les cellules dendritiques (CD) et neutrophiles, entre autres,¹⁰. Les cellules de la zone marginale sont exposés au flux unidirectionnel de sang provenant des artères spléniques qui se terminent par un sinus marginal entourant le follicule. Le sang coule des trous dans le sinus marginal par le biais de la zone marginale et est puis recueilli dans les sinus veineux dans la pulpe rouge et restauré à la circulation de¹¹. La libre circulation du sang se lave au cours des MZBs et les expose aux antigènes transportés dans le sang. Les MZBs portent l’antigène dans le follicule par navette automatiquement entre la zone marginale et à l’intérieur du follicule, ce qui n’est pas exposé à du sang. Ainsi, comme MZBs navette vers le follicule, ils doivent migrer vers le haut de la force de cisaillement de l’ écoulement de sang¹² (Figure 1 a).

Dans ce protocole, nous décrivons comment déterminer quantitativement comment immunitaire cellules tels que MZBs répondre à aucun débit ou haut débit in vitro, afin de révéler comment ils sont programmés pour migrer in vivo. Dans un premier temps, MZBs sont purifiés de la rate de souris à l’aide de billes magnétiques couplées à l’anticorps de kits disponibles dans le commerce. Les MZBs fraîchement isolées sont introduits dans le puits d’une coulée de chambre, autorisés à s’installer sur des ligands de l’intégrine et exposées à l’écoulement du tampon de migration à l’aide d’un système de pompe (Figure 2 a). Les cellules sont imagés à l’aide d’un système de microscopie vidéo Time-lapse. Les images sont ensuite traitées pour l’analyse avec un plugin d’ImageJ gratuit,^13,MTrack2¹⁴, pour suivre automatiquement les cellules. Titres peuvent ensuite être quantifiés avec Ibidi chimiotactisme gratuit outil¹⁵ à déterminer différents paramètres, notamment la vitesse, de rectitude et indice de migration. Ces valeurs peuvent être utilisées pour déterminer les effets des inhibiteurs de la migration, stimulateurs de la cellule, chimiokines et autres produits chimiques d’affecte la migration sur la migration de cisaillement-flux induit afin de comprendre les forces qui contrôlent le mouvement de cellules immunitaires in vivo.