Summary

小鼠边缘区 b 细胞剪切流诱导迁移的体外分析

Published: November 26, 2018
doi:

Summary

边缘区 b 细胞 (mzb) 通过调整其迁移路径的方向来响应剪切流的力。该协议演示了如何使用流体单元、泵、显微镜成像系统和自由软件记录和分析迁移。

Abstract

边缘区 b 细胞 (mzb) 是一种 b 细胞的群体, 它们位于包裹毛囊的小鼠脾边缘区。要到达毛囊, mzb 必须迁移血液流动的剪切力。本文提出了一种分析这种流动诱导的 mzb 体外迁移的方法。首先, mzb 从小鼠脾脏中分离出来。其次, mzb 在流动室滑块中的整合素配体上进行了确定, 暴露在剪切流中, 并在迁移过程中在显微镜下成像。第三, 迁移 mzb 的图像使用 imagej 的 mtrack2 自动单元跟踪插件进行处理, 并使用 ibidi 趋化工具对生成的单元跟踪进行量化。迁移数据揭示了细胞移动的速度、它们改变方向的频率、剪切流矢量是否影响其迁移方向以及涉及哪些整合素配体。虽然我们使用 mzb, 该方法可以很容易地适应分析任何白细胞的迁移, 响应剪切流的力量。

Introduction

免疫细胞是人体中运动最强的细胞, 往往必须与血液和淋巴流动的剪切力抗衡。然而, 关于白细胞12345的剪切力诱导迁移的研究相对较少。我们在这里提出了一个可靠的定量协议, 以分析免疫细胞在体外流动的反应。执行检测不需要制造组件, 所有设备和耗材均可在市场上获得。该协议, 包括细胞纯化和迁移分析, 可以在一天内完成。最后, 尽管我们描述了边缘区 b 细胞 (mzb) 的迁移, 但该协议可以用来分析其他类型免疫细胞的迁移。因此, 使用该方法系统地分析广泛的白细胞, 并对其进行全面的条件分析是可行的。

mzb 是 b 细胞的群体, 在小鼠体内, 仅存在于毛囊内部和边缘区 6789之间的脾脏和穿梭。边缘区域是一层大约5-10 个厚的免疫细胞。细胞层包裹毛囊, 主要由 mzb 和巨噬细胞组成, 但也包括不变的自然杀手 t (inkt) 细胞、树突状细胞 (dc) 和中性粒细胞等10。边缘区域的细胞暴露在来自脾动脉的单向血流中, 这些血流终止于卵泡周围的边缘窦。血液从边缘窦的洞中通过边缘区域流动, 然后收集在红色果肉中的静脉窦, 并恢复到循环11。血液的自由流动在 mzb 上冲走, 使它们暴露在血液中携带的抗原中。mzb 通过在边缘区域和毛囊内部之间自动穿梭, 将抗原带入毛囊, 而毛囊不受血液影响。因此, 当 mzb 向毛囊穿梭时, 它们必须迁移血流12的剪切力 (图 1a).

在这个协议中, 我们描述了如何定量地确定免疫细胞 (如 mzb) 在体外对无流动或高流量的反应, 以揭示它们是如何被编程在体内迁移的。在第一步中, mzb 从老鼠脾脏中纯化, 使用磁珠与市售试剂盒中的抗体结合。新隔离的 mzb 被引入流动室滑块的井中, 允许安装在整合素配体上, 并使用泵系统暴露在迁移缓冲流中 (图 2 a)。这些细胞是使用延时视频显微镜系统成像的。然后使用免费的 imagej 插件 mtrack2 13, 14图像进行分析, 以自动跟踪细胞。然后, 可以使用免费的 ibidi 趋化工具15对轨迹进行量化, 以确定各种参数, 包括速度、直线度和迁移指数。这些值可用于确定迁移抑制剂、细胞刺激器、趋化因子和其他影响迁移的化学品对剪切流诱导迁移的影响, 以了解控制体内免疫细胞运动的力量。

Protocol

根据马格德堡 ovgu 大学医学院医学院的所有准则, 所有涉及使用动物的实验都已得到德国萨克森-安哈勒 (萨克森-安哈尔特) 的批准。 1. mzb 细胞纯化 分离白细胞。 牺牲8到16周龄的老鼠, 切除脾脏16。将脾脏分解为5毫升的冰凉细胞缓冲液 [磷酸盐缓冲盐水 (pbs) + 0.5% 无脂肪酸的牛血清白蛋白 (bsa)], 方法是使用组织分离器或将脾脏轻轻?…

Representative Results

我们使用上面概述的协议比较了 mzb 在 icam-1 涂层幻灯片上的迁移, 没有流动 (0 dyn/cm2), 暴露在剪切流 (4 dyncm2) 中。使用 mtrack2 自动跟踪细胞, 并在无流动 (0 dyn/2) 和 (4 dyn/cm 2) 的细胞迁移电影上覆盖生成的轨道文件, 以显示轨道的分布和形状 (图 4a)。然后将单元轨道导入到 ibidi 趋化工具 (ict) 中, 以生成每部电影的跟踪情…

Discussion

我们在这里描述了一种方法来分析细胞的迁移, 检测剪切流的力量, 并通过改变它们的迁移来响应。对 mzb 的分析表明, mzb 在 icam-1 上自发迁移, 在流动的情况下, 会向上迁移流动。在前面的工作中, 我们展示了 mzb 不会在 vcam-1 上向上迁移流, 而是保持固定在适当的位置。小鼠脾边缘区主要含有 icam-1, 而红浆中含有 icam-1 和 vcam-1。从这些数据中可以推断, mzb 会在边缘区向上迁移流动, 但不会在红色纸浆…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了 “德意志论坛” sfb 854/tp11 至 k. d. f 的赠款。

Materials

VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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