Summary

استخدام النظم الآلية للعملية وتضمين Colonic موريني عينات لإجراء تحاليل نسيجية

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

الافتقار إلى التوحيد القياسي لتجهيز الأنسجة موريني يقلل نوعية التحليل نسيجية موريني مقارنة بالعينات البشرية. نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ دراسة نسيجية مورين الأنسجة colonic ملتهبة وأونينفلاميد لإظهار جدوى نظم الروبوتية المستخدمة بصورة روتينية لتجهيز وتضمينها العينات البشرية.

Abstract

فهم الأمراض البشرية قد اتسع إلى حد كبير بفضل دراسة نماذج حيوانية. ومع ذلك، يلزم نسيجية تقييم نماذج تجريبية دقيق الذي طبق للعينات البشرية. في الواقع، استخلاص نتائج موثوق بها ودقيقة حاسمة تتأثر بنوعية إعداد قسم الأنسجة. هنا، نحن وصف بروتوكول نسيجية تحليل الأنسجة موريني الذي يقوم بتنفيذ عدة خطوات الآلي أثناء الإجراء، من إعداد أولية لتضمين البارافين العينات موريني. يسهم في الحد المتغيرات المنهجية من خلال توحيد بروتوكول صارم من إجراءات التشغيل الآلي إلى زيادة الموثوقية العام للتحليل الباثولوجي مورين. على وجه التحديد، يصف استخدام التجهيز الآلي لهذا البروتوكول وتضمين أنظمة روبوتية، المستخدمة بشكل روتيني لمعالجة الأنسجة وتضمين البارافين العينات البشرية، لمعالجة العينات مورين من التهاب الأمعاء. نخلص إلى أن موثوقية نسيجية فحص الأنسجة مورين هو زيادة كبيرة عند إدخال تقنيات موحدة ومؤتمته.

Introduction

في العقود الأخيرة، وضعت عدة نماذج تجريبية لتشريح الآليات المسببة للأمراض المؤدية إلى الأمراض البشرية1،2. من أجل تقييم مدى خطورة المرض، يجب تقييم تأثير العلاج الباحثين ودراسة الاختلافات المعمارية الخلوية وغذائها أو مقدار التهاب3. هناك حاجة لتنفيذ تلك النماذج التجريبية، تحليلاً مفصلاً نسيجية، غالباً ما مقارنة العينات مورين والبشرية4،5.

بالإضافة إلى ذلك، عادة تجهيز العينات البشرية وسجل بالمرافق الأساسية التشريح المرضى والباثولوجيا البشرية ذوي الخبرة من خلال معايير نسيجية وأساليب موحدة. على العكس من ذلك، الأنسجة موريني هي عادة ثابتة والمضمنة وتحليلها من قبل الباحثين ذوي الخبرة المحدودة للبروتوكولات نسيجية. نوعية وموثوقية لدراسة نسيجية يبدأ بإعداد أقسام الأنسجة عالية الجودة. هناك عدة عوامل تساهم حاسمة في زيادة أو انخفاض نوعية التحليل النهائي، بما في ذلك التثبيت، العيانية تمزيقها، والتجهيز، البارافين التضمين، والتضمين من عينات6،7.

وتخضع جميع هذه المقاطع التي تنطوي على التلاعب بالعينة الأخطاء اليدوية، بما في ذلك الدمج اليدوي للعينات، وإلى حد أقل، مبضع اليدوي تمزيقها وتلطيخ. في الوقت الحاضر، تعتمد العملية برمتها من إعداد الأنسجة مورين للتقييم النسيجي على البروتوكولات التي تختلف من مختبر إلى مختبر والبروتوكولات اليدوي. والهدف من هذه الدراسة لتنفيذ بروتوكولات موحدة الآلي لتقليل الأخطاء وتقلبه في دراسة نسيجية موريني.

على حد علمنا، يصف لنا هنا البروتوكولات الأولى للأنسجة مؤتمتة بالكامل تجهيز وتضمينها للتقييم النسيجي للأنسجة مورين؛ هذه تستخدم بشكل روتيني في وحدات علم الأمراض لتحليل العينات البشرية. كمثال عملي لجدوى هذه الطريقة، نموذج موريني من التهاب الأمعاء قد تم تحليلها، أي النموذجي التهاب القولون المزمن الناجم عن الإدارة المتكررة من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) في مياه الشرب8 ،9. هذا الإعداد التجريبية عن كثب يشبه التهاب الأمعاء البشرية من الأمراض (بنك التنمية بين الأمريكتين)10 منذ DSS معاملة الحيوانات يحمل علامات التهاب الأمعاء، مثلاً، فقدان الوزن، البراز فضفاضة أو الإسهال، وتقصير القولون وكذلك التليف 89،،11. كما لاحظ للبشرية بنك التنمية بين الأمريكتين المرضى، يولد العلاج مفاجآت دورة مرض معقدة. في هذا السياق، يلزم وضع تقييمات النسيجي فهم التغيير العميق لهندسة الأنسجة. وبالتالي، تنفيذ البروتوكولات وصف لزيادة جودة إعداد عينة قد تفيد الباحثين الاعتماد على تفسير النسيجي والمناعي ويحلل لإعدادات التجريبية موريني. مورين نماذج تجريبية من الأمراض البشرية التي تنطوي على التعديلات لهندسة الأنسجة، وجود ارتشاح النسيج الخلوي أو التهاب في مختلف الأنسجة والأعضاء (الأمعاء، المخ، الكبد، الجلد) يمكن استخدام زيادة نوعية إعداد نموذج لدراسة نسيجية.

Protocol

إجراءات الحيوان كانت وافقت عليها وزارة الصحة (المصادقة 127/15، 27/13) الإيطالية واتبعت المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان للمعهد الأوروبي لعلم الأورام إياكوك (لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان مؤسسية) 1. المزمن التهاب القولون التعريفي بالإدارة المتكررة مفاجآت صيف دبي العمر منف…

Representative Results

التجريبية التهاب القولون المزمن الناجم عن الإدارة المتكررة لإدارة السلامة والأمن في مياه الشرب نموذج موريني من التهاب الأمعاء تشبه8،بنك التنمية بين الأمريكتين البشرية9. ويصف الشكل 1 آثار العلاج إدارة السلامة والأمن، بما ?…

Discussion

فنحن نستخدم مختلف الخطوات الآلي أثناء إعداد الأنسجة مورين لتحليل الأنسجة. ويهدف هذا البروتوكول توفير تلميحات التقنية لزيادة في إمكانية تكرار نتائج والتوحيد للعملية برمتها، ومن ثم تعزيز الجودة الشاملة للتقييم النهائي نسيجية. قمنا بتنفيذ الصكوك الآلي وأساليب الإعداد والتضمين من الأنسجة?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر إدارة علم الأمراض من مستشفى Policlinico إيرككس وميلانو للدعم التقني ومرفق IEO الحيوان للمساعدة في تربية الحيوانات.

Materials

Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10X SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1X Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

Referenzen

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
  7. Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

View Video