Summary

ロボット システムを使用して処理し、組織学的解析のため大腸マウス サンプルを埋め込む

Published: January 07, 2019
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Summary

マウスのティッシュの処理の標準化の欠如は、人体標本と比較するとマウスの病理組織学的解析の画質を低下させます。ここでは、炎症や uninflamed での処理とひと試料を埋め込むのため日常的にロボット システムの可能性を示すため大腸組織をマウスの病理組織学的検査を行うためのプロトコルを提案する.

Abstract

人間の病気の理解は、動物モデルの研究のおかげで大幅に拡張されています。それにもかかわらず、実験モデルの病理組織学的評価は厳格ひと試料に適用する必要があります。確かに、信頼性と正確な結論を導き出す、ティッシュ セクションの準備の質によって影響批判的に。ここでは、マウスのサンプルのパラフィン包埋する初期の準備から、手順の中にいくつかの自動化された手順を実装するマウス組織の病理組織学的解析のためのプロトコルについて述べる。自動化された手順から厳格なプロトコルの標準化、方法論的変数の削減は、マウスの病態解析の全体的な信頼性の向上に貢献します。具体的には、このプロトコル処理の自動化の使用率について説明します、ロボット システムを埋め込む日常的に使用ティッシュの処理、パラフィン包埋ひと試料の腸管炎症のマウス試験片を処理します。マウス組織の病理組織学的検査の信頼性が標準化と自動化技術の導入時に著しく増加することが分かった。

Introduction

最後の十年では、人間の病気1,2につながる病原性のメカニズムを解剖するいくつか実験的なモデルが開発されています。疾患の重症度を評価するために研究者は治療の効果の評価、細胞学的・組織学的アーキテクチャのバリエーションや炎症3の量を研究する必要があります。それらの実験モデルに実行するには、多くの場合マウスと人間のサンプル4,5を比較詳細な病理組織学的解析が必要です。

また、ひと試料は一般的処理および病理コア施設で得点、を通して経験豊富な人間の病理病理組織学的基準・方法の標準化します。逆に、マウス組織は通常固定、埋め込まれ、病理組織学的プロトコルの限られた経験を持つ研究者によって分析しました。病理組織学的検査の信頼性と品質高品質ティッシュ セクションの準備から始まります。いくつかの要因は、固定、マクロを含む、最終的な分析の品質区分、処理、パラフィンの埋め込みと埋め込みサンプル67の増減に批判的に貢献します。

サンプルの操作を含むすべてのこれらの通路は、マニュアル サンプルの埋め込みなど、手作業によるエラーより少ない程度に、手動ミクロトーム切片および汚損にさらされます。現時点では、組織学的評価のためのマウスのティッシュの準備のプロセス全体は、マニュアルや研究室から研究室を異なるプロトコルに依存します。本研究の目的は、マウスの病理組織学的検査の変動とエラーを減らすために標準化された自動化されたプロトコルを実装することです。

我々 の知識を述べるここで完全に自動化された組織処理およびマウスの組織の組織学的評価のための埋め込みの最初のプロトコルこれらは日常的に病理単位で人体標本の分析に使用されます。メソッドの実行可能性の実用的な例として腸炎のマウスモデルが分析されて、すなわち, , 慢性大腸炎モデルによる飲料水8 デキストラン ナトリウム硫酸塩 (DSS) の反復投与、9。DSS 投与動物は、体重減少、軟便または下痢、そして線維症と同様、大腸の短縮など腸の炎症の兆候を示すので人間の炎症性腸疾患 (IBD)10のような密接にこの実験的設定8,9,11。人間の IBD 患者の観察、DSS 治療は複雑な病気のコースを生成します。この文脈では、精巧な組織学的評価は、組織アーキテクチャの深遠な変更を理解する必要があります。したがって、サンプル準備の質を高めるための説明のプロトコルの実装が組織学的の解釈に依存する研究者を受けることが、マウス実験的設定の免疫組織化学的解析。実験モデルマウスの組織構造変化を伴う疾患の細胞組織潜入やさまざまな組織、臓器 (腸、脳、肝臓、皮膚) の炎症の存在使用の品質が向上した、病理組織学的検査のための試料調製。

Protocol

動物の手続き健康 (認証 127/15、27/13) イタリア省によって承認され、腫瘍 IACUC (制度的ケアおよび使用委員会) の欧州研究所の動物のケアのガイドライン 1. 慢性大腸炎反復的な DSS 投与による誘導 別年齢とセックス (H2O 対 DSS 処理, 実験群あたり少なくとも 5 マウス同腹子) 2 つのグループのマウスに一致。 2.5% を管理 DSS (40 kDa) 治療グループに 7 日と?…

Representative Results

飲料水の DSS の反復投与による実験的慢性大腸炎は、密接に人間の IBD8,9に似た腸内の炎症のマウス モデルです。図 1大腸の短縮の (図 1 a)、DSS 誘発炎症の有無、大腸CXCL10 を含むプロ炎症性の遺伝子発現を獲得する広く使用されるパラメーターを含む DSS 治療の効果を説明しま?…

Discussion

マウス組織の病理組織学的解析のための準備の間に別の自動化された手順を利用します。このプロトコルは、最終的な病理組織学的評価の全体的な品質を高め、全体のプロセスの標準化し、再現性を高めるための技術的なヒントを提供することを目指しています。自動化された器械と準備をし、組織、人間標本の調査のため病理コア施設で日常的に使用の埋め込み法を実施しています。

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々 は動物飼育で IEO 動物施設支援のため、テクニカル サポートのためのミラノ IRCCS ポリクリニコ病院の病理を感謝します。

Materials

Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10X SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1X Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

Referenzen

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
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  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

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Diesen Artikel zitieren
Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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