Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques
Summary
Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.
Abstract
Nous avons développé un outil pour enrichir et développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Cela peut être utile dans des cas tels que A) détecter l’existence de lymphocytes T spécifiques de l’antigène, B) sonde la dynamique des réactions antigène-spécifiques, C) comprendre les réactions antigène-spécifiques influencent l’état de la maladie telles que l’auto-immunité, D) démystifier hétérogènes réponses spécifiques de l’antigène des cellules T, ou E) utilisent des cellules antigène-spécifiques pour la thérapie. L’outil est basé sur une particule magnétique que nous avons conjugué antigène-spécifiques et les signaux de costimulation des lymphocytes T, et que nous appelons comme artificiels (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Par conséquent, étant donné que la technologie est simple à réaliser, il pourra facilement être adopté par d’autres laboratoires ; ainsi, notre but ici est de décrire en détail la fabrication et l’utilisation subséquente de la vamp. Nous expliquons comment attacher les signaux de costimulation et antigène-spécifiques à la VAMP, comment les utiliser pour enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et comment développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Par ailleurs, nous mettrons en évidence de conception technique, les considérations liées à l’information expérimentale et biologique de notre expérience avec la caractérisation des cellules T spécifiques de l’antigène.
Introduction
Avec la montée des immunothérapies beaucoup, il y a un besoin d’être en mesure de caractériser et de contrôler les réponses immunitaires. En particulier, la réponse immunitaire adaptative est intéressant en raison de la spécificité et la longévité des cellules. Récemment, les thérapies de récepteurs chimériques-antigène des lymphocytes T ont été approuvés pour le traitement du cancer ; Cependant, les récepteurs d’antigènes sont basées hors de la cellule surface antigène commun CD19, au lieu des antigènes spécifiques du cancer1. Au-delà de la spécificité, immunothérapies peuvent aussi souffrent du manque de contrôle et limitée à comprendre la réponse immunitaire dynamique au sein du cancer ou d’auto-immunité.
Un des défis de l’étude des réponses spécifiques à l’antigène est leur fréquence extrêmement basse, par exemple., lymphocytes T antigène-spécifiques sont : 1 de chaque 104 106 T cellules2,3. Ainsi, afin d’étudier quel T, les cellules sont présentes ou en réponse, les cellules doivent soit être enrichi et élargi, ou besoin de leur signal à amplifier. C’est cher et difficile à maintenir les cellules nourricières en utilisant les techniques actuelles qui mettent l’accent sur l’expansion des cellules antigène-spécifiques. Les techniques actuelles qui mettent l’accent sur l’amplification du signal de T antigène-spécifiques des cellules, comme le dosage de l’enzyme-linked immunospot (ELISPOT), limiter la réutilisation de ces cellules T4. Enfin, en raison de la faible sensibilité, souvent ces deux techniques doivent être combinés pour le dénombrement de l’antigène-spécifiques.
Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé l’antigène artificiel à base de nanoparticules magnétiques présentant cellulaire (VAMP)5,6,7,8. La VAMP peut être fonctionnalisée avec un complexe antigène-spécifiques-peptide signal chargé majeur d’histocompatibilité (pMHC) et les molécules de costimulation –e.g., un anticorps anti-CD28-à la fois enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et puis par la suite stimuler leur expansion (Figure 1). Les particules peuvent ainsi être un produit sur étagère rentable qui peut être aussi bien personnalisé pour répondre aux stimulations de l’antigène-spécifiques encore standardisé à travers des expériences et des patients. L’enrichissement et l’expansion traiter les résultats dans des centaines de milliers-pli expansion des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène et peut entraîner des fréquences jusqu’à 60 pour cent après seulement une semaine, ce qui permet la caractérisation ou l’utilisation thérapeutique des grandes nombre de cellules. Dans les présentes, nous expliquent comment faire des nanoparticules Vamp, quelques considérations de conception critiques dans le choix des propriétés de nanoparticules et démontrer certains résultats typiques de l’utilisation de ces particules à isoler et à développer des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène rares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons créé une technologie d’isolement des lymphocytes de T antigène-spécifiques nouveaux issue des nanoparticules artificiel (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Vamp de nanoparticules ont peptide-chargés MHC sur la surface qui permet la liaison spécifique de l’antigène des lymphocytes T et activation aux côtés de costimulation activation. Vamp est également paramagnétique et donc peut être utilisé pour enrichir les rares cellules de T antigène-spécifiques en utilisant un champ mag…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. remercie le centre de formation de la nanotechnologie de Cancer NIH au Johns Hopkins Institute nanobiotechnologie, la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures (DGE-1232825) et la Fondation d’ARCS de soutien de la bourse. Ce travail a été financé par le soutien de la National Institutes of Health (P01-AI072677, CA108835-R01, R21-CA185819), Initiative Innovation TEDCO/Maryland et la Fondation Coulter (JPS).
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
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