Summary

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Published: January 18, 2019
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Summary

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Abstract

Ganze Zelle Patch-Clamp-Studien von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) haben einen großen Bestand an Informationen über die Wirbelsäulen Mechanismen sensorischer Übertragung, nozizeptiven Regulierung und chronische Schmerzen oder Juckreiz Entwicklung zur Verfügung gestellt. Implementierungen von elektrophysiologische Aufnahmen zusammen mit morphologischen Studien basierend auf die Nützlichkeit des akuten Rückenmark Scheiben haben unser Verständnis der neuronalen Eigenschaften und die Zusammensetzung der lokalen Schaltung in SG weiter verbessert. Hier präsentieren wir Ihnen eine ausführliche und praktische Anleitung für die Zubereitung von Rückenmark Scheiben und zeigen repräsentative ganze Zelle Aufnahme und morphologischen Ergebnisse. Dieses Protokoll ermöglicht ideale neuronalen Erhaltung und in-Vivo -Bedingungen bis zu einem gewissen Grad zu imitieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, die Fähigkeit, eine in-vitro- Vorbereitung des Rückenmarks Scheiben zu erhalten ermöglicht stabile Strom und Spannung-Klemme Aufnahmen und könnte somit detaillierte Untersuchungen in der inneren Membran Eigenschaften, lokalen Schaltung erleichtern und neuronale Struktur mit vielfältigen experimentellen Ansätzen.

Introduction

Die Substantia Gelatinosa (SG, Lamina II der spinalen Hinterhorn) ist ein unbestreitbar wichtig Relais für Sende- und Regulierung von sensorischen Informationen. Es besteht aus exzitatorischen und inhibitorischen Interneuronen, die Eingänge von den primären afferenten Fasern, lokale Interneuronen und der endogenen absteigenden hemmenden System1erhalten. In den letzten Jahrzehnten konnten die Entwicklung der akuten Rückenmark Slice Vorbereitung und dem Aufkommen der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verschiedene Studien über die inhärenten elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften von SG Neuronen2, 3 , 4 sowie Studien über die lokalen Schaltung in SG5,6. Darüber hinaus durch die Verwendung der in-vitro- Rückenmark Slice Vorbereitung, Forscher interpretieren können die Änderungen in neuronalen Excitabilities7,8, die Funktion der Ionen-Kanäle9,10, und synaptische Aktivitäten11,12 unter verschiedenen pathologischen Bedingungen. Diese Studien haben unser Verständnis von der Rolle der SG Neuronen in der Entwicklung und Instandhaltung von chronischen Schmerzen und neuropathischen Juckreiz vertieft.

Im Wesentlichen ist die wesentliche Voraussetzung für eine klare Visualisierung der neuronalen Soma und ideale ganze Zelle Patchen mit akuten Rückenmark Scheiben zu erreichen um die hervorragende Qualität der Scheiben zu gewährleisten, so gesunde und patchbare Neuronen erreicht werden können. Allerdings umfasst bereitet Rückenmark Scheiben mehrere Schritte, wie das Durchführen einer ventralen Laminektomie und Entfernen der Pia-Arachnoidea-Membran, die Hindernisse bei der Beschaffung von gesunder Scheiben werden kann. Obwohl es nicht einfach zuzubereitende Rückenmark Scheiben, hat Durchführung von Aufnahmen in Vitro am Rückenmark Scheiben mehrere Vorteile. Im Vergleich zu Zelle Kultur Vorbereitungen, erhalten Rückenmark Scheiben teilweise inhärente synaptische Verbindungen, die in einem physiologisch relevanten Zustand befinden. Darüber hinaus könnten ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahme mit Rückenmark Scheiben mit anderen Techniken, wie z. B. doppelte Patch Clamp13,14, morphologische Studien15,16 und einzellige RT-PCR kombiniert werden 17. daher, diese Technik enthält weitere Informationen zur Charakterisierung der anatomische und genetische Unterschiede innerhalb einer bestimmten Region und ermöglicht die Untersuchung der Zusammensetzung der lokalen Schaltung.

Hier bieten wir eine grundlegende und detaillierte Beschreibung unserer Methode für die Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben und ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von SG Neuronen zu erwerben.

Protocol

Die Tier Ethik Komitee von Nanchang University (Nanchang, VR China, ethische No.2017-010) stimmten alle experimentelle Protokolle beschrieben. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um den Stress und die Schmerzen der Versuchstiere zu minimieren. Die elektrophysiologischen Aufnahmen, die hier aufgeführt wurden bei Raumtemperatur (RT, 22 – 25 ° C) durchgeführt. (1) Tiere Verwenden Sie Sprague-Dawley Ratten (3 – 5 Wochen alt) beiderlei Geschlechts. Beherbergen Sie die Tiere unte…

Representative Results

Akuten Rückenmark Scheiben wurden entsprechend dem Diagramm in Abbildung 1dargestellte vorbereitet. Nach dem Schneiden und Wiederherstellung wurde eine Rückenmark-Scheibe zur Aufnahme Kammer übertragen. Gesunde Neuronen wurden identifiziert, basierend auf Soma Auftritt mit IR-DIC Mikroskopie. Als nächstes wurden die Aktionspotentiale der SG Neuronen durch eine Reihe von depolarisierende Stromimpulse (1 s Dauer) ausgelöst wenn Neuronen bei RMP gehalten wu…

Discussion

Dieses Protokolldetails der Schritte für die Zubereitung von Rückenmark Slices, die wir erfolgreich eingesetzt haben, wenn ganze Zelle Patch-Clamp-Experimenten auf der SG Neuronen18,19,20,21. Durch die Implementierung dieser Methode, wir berichteten kürzlich, dass Minocyclin eine zweite Generation von Tetracyclin, inhibitorischen synaptischen Übertragung durch einen präsynaptischen Mechani…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr. 81560198, 31660289).

Materials

NaCl Sigma S7653 Used for the preparation of ACSF and PBS
KCl Sigma 60130 Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2O Sigma 71500 Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2O Sigma C5080 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2O Sigma M2670 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3 Sigma S5761 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-Glucose Sigma G7021 Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acid Sigma P5280 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvate Sigma A7631 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sucrose Sigma S7903 Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconate Wako 169-11835 Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-Phosphocreatine Sigma P1937 Used for the preparation of intracellular solution
EGTA Sigma E3889 Used for the preparation of intracellular solution
HEPES Sigma H4034 Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATP Sigma A9187 Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTP Sigma G5884 Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4 Sigma C1426 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsCl Sigma C3011 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-Cl Sigma T2265 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488 Vector SP-1145 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
Agar Sigma A7002 3% agar block was used in our protocol
Paraformaldehyde Sigma P6148 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4 Hengxing Chemical Reagents Used for the preparation of PBS
Mount Coverslipping Medium Polyscience 18606
Urethan National Institute for Food and Drug Control 30191228 1.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments TW150F-4 1.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette puller Sutter Instrument P-97 Used for the preparation of micropipettes
Vibratome Leica VT1000S
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corporation 63544
Infrared CCD camera Dage-MIT IR-1000
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285
X-Y stage Burleigh GIBRALTAR X-Y
Upright microscope Olympus BX51WI
Osmometer Advanced FISKE 210
PH meter Mettler Toledo FE20
Confocol microscope Zeiss LSM 700

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Zhu, M., Zhang, D., Peng, S., Liu, N., Wu, J., Kuang, H., Liu, T. Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons. J. Vis. Exp. (143), e58479, doi:10.3791/58479 (2019).

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